【摘要】：輸液可以應對很多臨床上的狀況,從整個世界來看,對輸液的需求越來越高。但是獻血資源是一種短缺的資源,而且伴隨著很多副作用。這些都驅(qū)使人們?nèi)ふ乙环N全血的替代品用于輸液治療。其中很重要的一種思路就是使用無細胞的重組血紅蛋白來做為氧載體,即重組血紅蛋白類氧載體。對于重組血紅蛋白類氧載體的研究已經(jīng)有多年的歷史,本文在前人的基礎上提出一種新的構(gòu)建重組血紅蛋白類氧載體的方式,通過構(gòu)建白蛋白血紅蛋白融合蛋白以及在血紅蛋白基因中引入點突變來克服重組血紅蛋白類氧載體輸入人體后會引起的副作用。實驗目的:本實驗的目的是構(gòu)建白蛋白血紅蛋白α融合蛋白,從而顯著增大該重組血紅蛋白的分子量,降低腎毒性。另一方面在血紅蛋白基因中引入三個定點突變,降低其與NO結(jié)合的能力,從而解決重組血紅蛋白類氧載體輸入人體內(nèi)會引起的高血壓問題。然后體外表達該重組血紅蛋白類氧載體。方法與結(jié)果:本實驗用一段短的Linker DNA將白蛋白與血紅蛋白α基因連接起來,并采用重疊延伸PCR的方法在人血紅蛋白基因中引入三個定點突變。選取合適的酶切位點,將白蛋白血紅蛋白α基因以及血紅蛋白β基因連入原核雙表達載體pETDuet1中,隨后將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株Origami DE3中,用IPTG誘導目的基因的表達。本實驗成功的構(gòu)建出了一種重組血紅蛋白雙表達載體,并在特定的大腸桿菌表達菌株中成功的表達出了該重組血紅蛋白基因。本實驗為以后進一步純化該重組血紅蛋白并用于臨床實驗奠定了基礎。
[Abstract]:Infusion can cope with many clinical conditions, and the need for infusion is increasing throughout the world. But blood donation is a scarce resource with many side effects. All this drives people to look for a whole-blood substitute for infusion therapy. One of the most important ideas is to use cell-free recombinant hemoglobin as oxygen carrier, that is, recombinant hemoglobin oxygen-like carrier. There have been many years of research on the recombinant hemoglobin oxygen-like carrier. This paper proposes a new way to construct the recombinant hemoglobin oxygen-like carrier on the basis of previous studies. By constructing albumin hemoglobin fusion protein and introducing point mutation into hemoglobin gene, the side effects caused by recombinant hemoglobin oxygen-like vector were overcome. Objective: to construct the albumin hemoglobin 偽 fusion protein, and to increase the molecular weight of the recombinant hemoglobin and reduce the nephrotoxicity. On the other hand, three site-directed mutations were introduced into the hemoglobin gene to reduce its ability to bind to no, thus solving the problem of hypertension caused by the introduction of the recombinant hemoglobin oxygen-like vector into human body. Then the recombinant hemoglobin oxygen-like vector was expressed in vitro. Methods and results: in this experiment, a short Linker DNA was used to link albumin with hemoglobin 偽 gene, and three site-directed mutations were introduced into human hemoglobin gene by overlapping extended PCR. The albumin hemoglobin 偽 gene and hemoglobin 尾 gene were linked into the prokaryotic expression vector pETDuet1, and the constructed expression vector was transformed into the E. coli expression strain Origami DE3. The expression of target gene was induced by IPTG. In this experiment, a recombinant hemoglobin double expression vector was successfully constructed, and the recombinant hemoglobin gene was successfully expressed in a specific Escherichia coli expression strain. This study laid a foundation for further purification and clinical application of the recombinant hemoglobin.
【學位授予單位】：江蘇師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R3411;Q78

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本文編號：2197909