【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis,TB)一直是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共健康問題,其死亡率居于單一細(xì)菌感染致死亡性疾病之首。傳統(tǒng)的結(jié)核病檢測(cè)方法有痰涂片,痰培養(yǎng),PCR,ELISPOT, TST,胸片等,但是它們存在明顯的不足,比如有的耗時(shí)較長(zhǎng),有的假陽性率高,而且不能對(duì)結(jié)核分枝桿菌菌陰的病人進(jìn)行正確診斷。因此需要尋找一種準(zhǔn)確、快速、新的診斷方法,為后期臨床治療提供依據(jù)�，F(xiàn)今細(xì)胞免疫檢測(cè)方法使用的抗原有ESAT-6, CFP10和TB7.7,血清學(xué)檢測(cè)使用的抗原是38kDa(Rv0934)。目前臨床上使用的唯一預(yù)防性結(jié)核病疫苗-卡介苗對(duì)兒童結(jié)核性腦膜炎具有保護(hù)作用,但是對(duì)青少年和成人的肺結(jié)核保護(hù)力為0-80%,具有可變性。因此迫切需要研制新型有效的結(jié)核病疫苗。本研究通過篩選結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白和膜蛋白,尋找潛在的新型結(jié)核病疫苗免疫組分和診斷分子標(biāo)識(shí)候選抗原。首先使用生物信息學(xué)軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株全蛋白質(zhì)組進(jìn)行預(yù)測(cè)分析確定研究對(duì)象。然后將入組的膜蛋白和分泌蛋白進(jìn)行重組表達(dá)。對(duì)表達(dá)獲得的重組蛋白逐一進(jìn)行Western Blot和ELISPOT篩選,根據(jù)第二輪細(xì)胞免疫篩選結(jié)果選取5個(gè)蛋白進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證5個(gè)蛋白在C57BL/6小鼠體內(nèi)的免疫原性。最終結(jié)果如下：經(jīng)生物信息學(xué)軟件對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的3989個(gè)開放閱讀框編碼的蛋白預(yù)測(cè)確定有240個(gè)開放閱讀框編碼的膜蛋白和242個(gè)開放閱讀框編碼的分泌蛋白入組。本研究利用Gateway系統(tǒng)和一步克隆法成功構(gòu)建了467個(gè)表達(dá)克隆,通過兩輪表達(dá)得到219個(gè)膜蛋白、141個(gè)分泌蛋白。將所有純化得到的蛋白使用離子軌道肼質(zhì)譜驗(yàn)證重組蛋白的蛋白序列是否正確,經(jīng)驗(yàn)證360個(gè)蛋白序列全部正確,正確率100%。經(jīng)過使用229個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病病人血清進(jìn)行三輪蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)篩選得到18個(gè)膜蛋白、26個(gè)分泌蛋白反應(yīng)強(qiáng)度與陽性對(duì)照Rv0934的峰面積比值大于1。每個(gè)蛋白使用3個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病人PBMC進(jìn)行ELISPOT,初次篩選使用73個(gè)活動(dòng)性肺結(jié)核病人PBMC。經(jīng)過初步篩選得到8個(gè)膜蛋白、9個(gè)分泌蛋白平均反應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到陽性對(duì)照ESAT-6的50%以上。將Western Blot初步篩選得到的17個(gè)蛋白使用健康人和病人血漿進(jìn)行復(fù)篩,得到5個(gè)蛋白反應(yīng)在健康人和病人血漿中反應(yīng)具有差異。將ELISPOT初步篩選結(jié)果得到的17個(gè)蛋白使用15個(gè)ESAT-6陽性病人 PBMC進(jìn)行復(fù)篩,得到5個(gè)蛋白反應(yīng)強(qiáng)度達(dá)到陽性對(duì)照ESAT-6的40%以上,可以作為目標(biāo)候選抗原；6個(gè)ESAT-6陰性病人PBMC進(jìn)行復(fù)篩,3個(gè)蛋白可能與ESAT-6互為補(bǔ)充,與ESAT-6組合使用可能會(huì)提高活動(dòng)性肺結(jié)核檢測(cè)的吻合率。蛋白免疫小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S43蛋白能刺激小鼠CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ, CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2；S4蛋白能刺激小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-yo M62, M15, M1蛋白能刺激小鼠CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。M15, M1, S43, S4, S71作為抗原刺激脾細(xì)胞時(shí),可以觀察到CD4+T, CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖現(xiàn)象,但是與PBS對(duì)照組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)M15, M1, S43, S4, S71作為抗原刺激脾細(xì)胞時(shí),可以檢測(cè)到不同細(xì)胞因子不同程度的分泌。本研究已經(jīng)獲得了10個(gè)候選蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫、及免疫原性的初步結(jié)果。這10個(gè)蛋白的應(yīng)用價(jià)值需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。綜上所述,我們首次對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的膜蛋白和分泌蛋白進(jìn)行系統(tǒng)研究,得到了一系列可以用作疫苗候選物或是診斷標(biāo)識(shí)的蛋白。由于結(jié)核分枝桿菌的復(fù)雜性,大規(guī)模的蛋白質(zhì)組學(xué)研究無論是發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核病疫苗免疫組分還是尋找新的診斷標(biāo)識(shí)都具有深遠(yuǎn)影響,改善現(xiàn)有的結(jié)核病的預(yù)防和診斷現(xiàn)狀。因此,這種蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有良好的發(fā)展前景,或許還可以推廣到尋找生物體的新抗原的研究中。
[Abstract]:Tuberculosis (TB) has always been a serious global public health problem with the highest mortality rate of a single bacterial infection. Traditional TB detection methods include sputum smear, sputum culture, PCR, ELISPOT, TST, chest X-ray, etc. But they have obvious shortcomings, such as time-consuming and high false positive rate. Therefore, it is necessary to find an accurate, rapid and new diagnostic method to provide the basis for the later clinical treatment. The antigens used in cell immunoassay are ESAT-6, CFP10 and TB7.7, and the antigens used in serological detection are 38kDa (Rv0934). Bacillus Calmette-Guerin (BCG), the only preventive tuberculosis vaccine, has a protective effect on tuberculous meningitis in children, but the protective power against tuberculosis in adolescents and adults is 0-80%. Therefore, a new and effective tuberculosis vaccine is urgently needed. Immunocomponent and diagnostic molecule marker candidate antigens of type B tuberculosis vaccine. First, the whole proteome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain was predicted and analyzed by bioinformatics software. Then the membrane proteins and secreted proteins were recombined and expressed. ELISPOT screening, according to the results of the second round of cellular immune screening, five proteins were selected for animal experiments to verify the immunogenicity of five proteins in C57BL/6 mice. In this study, 467 expression clones were successfully constructed using Gateway system and one-step cloning method. 219 membrane proteins and 141 secretory proteins were obtained through two rounds of expression. All purified proteins were identified by ion-orbital hydrazine mass spectrometry. The results showed that the 360 protein sequences were correct, and the correct rate was 100%. 18 membrane proteins were screened by three rounds of immunoblotting test using 229 active tuberculosis patients'serum. The peak area ratio of 26 secretory proteins to positive control Rv0934 was greater than 1. Each protein used 3 active tuberculosis. ELISPOT was used to screen 73 active pulmonary tuberculosis patients for the first time. After preliminary screening, 8 membrane proteins were obtained. The average reaction intensity of 9 secretory proteins reached more than 50% of the positive control ESAT-6. Western Blot screened 17 proteins using healthy and patient plasma for screening, and 5 protein reactions were obtained. The results of ELISPOT preliminary screening showed that 17 proteins were screened by 15 ESAT-6 positive patients with PBMC, and 5 proteins with a reaction intensity of more than 40% of the positive control ESAT-6 could be used as the target candidate antigen; 6 ESAT-6 negative patients with PBMC were screened, and 3 proteins were possible. The results showed that S43 protein could stimulate CD4 +, CD8 + T lymphocytes to produce IFN - gamma, CD8 + T lymphocytes to produce IL - 2, and S4 protein could stimulate CD8 + T lymphocytes to produce IFN - yo M62, M15, M1 protein to spine. The proliferation of CD4+T and CD8+T lymphocytes was observed when stimulating spleen cells with IL-2.M15, M1, S43, S4 and S71 as antigens, but there was no significant difference compared with PBS control group. Secretion. Preliminary results of humoral and cellular immunity and immunogenicity of 10 candidate proteins have been obtained. The application value of these 10 proteins needs further study and verification. In summary, we have systematically studied the membrane proteins and secretory proteins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv for the first time, and obtained a series of vaccines that can be used as vaccines. Because of the complexity of Mycobacterium tuberculosis, large-scale proteomics studies have far-reaching implications for both discovering new immune components of tuberculosis vaccines and finding new diagnostic markers to improve the current status of tuberculosis prevention and diagnosis. Good prospects for development may also be extended to search for new antigens in organisms.
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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