【摘要】：腸病毒(Enteroviruses,EV)為小RNA病毒科中最主要的病毒屬,包含12個(gè)種300多個(gè)型別,廣泛感染人類。在基本消滅脊髓灰質(zhì)炎后,以腸病毒71(Enterovirus71,EV71)和柯薩奇病毒A16(Coxsackie viruses A16,CA16)為主的包括CA6、CA10、CA5和CB3(Coxsackievirus B3)在內(nèi)的多個(gè)型別腸病毒感染所引起的手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)成為腸病毒感染最嚴(yán)重的疾病,在我國及亞太其他地區(qū)持續(xù)高強(qiáng)度流行或散發(fā),除了引發(fā)各種程度的臨床病癥外,還可導(dǎo)致死亡,嚴(yán)重威脅公共健康。目前,對(duì)于HFMD尚無特異有效的治療藥物和疫苗。宿主的體液免疫在防御病毒感染中起到舉足輕重的作用,但目前對(duì)腸病毒在人群中的感染流行規(guī)律以及宿主如何抵抗、清除腸病毒感染的認(rèn)識(shí)仍存在許多不足,給疾病的有效防治帶來很多困難。在宿主應(yīng)對(duì)EV71和CA16等腸病毒感染的體液免疫反應(yīng)方面,目前的研究成果主要在中和抗體反應(yīng)方面,腸病毒感染后宿主不僅產(chǎn)生中和抗體,也產(chǎn)生非中和抗體,這種非中和抗體反應(yīng)如何產(chǎn)生,對(duì)中和抗體反應(yīng)是否有影響,是否普遍存在于宿主的腸病毒感染過程中?本研究將對(duì)這些問題進(jìn)行研究,以了解宿主非中和抗體反應(yīng)的特點(diǎn)及意義,為深入、全面理解腸病毒與宿主相互作用規(guī)律提供新的資料,并最終能為提高腸病毒感染的防控水平提供新的視野。主要內(nèi)容如下:一、人體抗-EV71衣殼蛋白非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)的研究在全基因合成獲得的EV71衣殼蛋白VP1、VP0和VP3的p MD-18T質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,通過PCR方法獲得EV71 VP0、VP3、VP1和VP1截短體抗原(VP11-60(1-60aa)、VP145-58(45-58aa)、VP141-297(41-297aa)、VP161-297(61-297aa)和VP1134-297(134-297aa))的DNA序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化獲得重組目的蛋白。以本室自主研發(fā)的新型免疫球蛋白結(jié)合分子(novel evolved immunoglobulin-binding molecule,NEIBM)LD5作為酶標(biāo)二抗,建立抗-EV71衣殼蛋白抗體檢測的NEIBM-ELISA方法。收集江蘇省無錫市33份HFMD重癥患者血清標(biāo)本、194份非手足口病兒童門診血清標(biāo)本和200份上海市正常獻(xiàn)血員血清標(biāo)本。應(yīng)用NEIBM-ELISA方法分析33份HFMD重癥患者和200份正常成人血清抗-EV71衣殼蛋白VP1、VP0和VP3的非中和抗體反應(yīng)。為進(jìn)一步研究抗-EV71 VP1主要抗體反應(yīng)表位,篩選正常成人、非HFMD門診兒童和HFMD重癥患者中抗-EV71 VP1高反應(yīng)性血清標(biāo)本,應(yīng)用EV71 VP1不同截短體抗原(VP141-297、VP161-297、VP11-60、VP1134-297和VP145-58)對(duì)上述高反應(yīng)血清進(jìn)行NEIBM-ELISA檢測,并用不同EV71 VP1截短體與全長VP1競爭結(jié)合三種人群高反應(yīng)血清抗-EV71 VP1抗體,探討EV71各結(jié)構(gòu)蛋白及其抗原成分體液免疫反應(yīng)特征,了解宿主對(duì)EV71及相關(guān)腸病毒感染的非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HFMD重癥病例和正常成人血清中均存在高水平的抗-EV71三種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1+VP0+VP3)抗體反應(yīng),抗-EV71 VP1的抗體陽性率和反應(yīng)性明顯高于抗-EV71 VP0和抗-EV71 VP3;包含腸病毒共同交叉反應(yīng)序列(the common enterovirus cross-reactive sequence,CEC RS)的VP141-297、VP11-60和VP145-58顯示出較高的反應(yīng)性,而不含CECRS的VP161-297和VP1134-297反應(yīng)性較差;競爭抑制結(jié)果也顯示,包含CECRS的全長VP1和VP1截短體抗原(VP141-297,VP11-60和VP145-58)抗-EV71 VP1的競爭水平明顯高于不包含CECRS的VP1截短體(VP161-297),且不同VP1抗原對(duì)EV71 VP1抗體反應(yīng)的競爭抑制模式在三種人群中也明顯不同。以上結(jié)果說明人群普遍存在高水平的抗-EV71衣殼蛋白抗體反應(yīng),且以抗-VP1反應(yīng)性最強(qiáng),為優(yōu)勢抗體反應(yīng);進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抗-EV71 VP1的抗體反應(yīng)主要針對(duì)基于CECRS的各類表位,這些表位主要可分為3類:核心抗原(VP145-58)、N抗原(VP11-60)和C抗原(VP141-297)。VP11-297為全抗原,由CECRS抗原(核心抗原、N抗原和C抗原)和其他非CECRS抗原組成。與特異性強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)不同,我們用NEIBM-ELISA所檢測的抗-EV71 VP1抗體反應(yīng)具有反應(yīng)強(qiáng)度大和交叉性強(qiáng)的特點(diǎn),將其定義為非中和抗體反應(yīng),并假設(shè)其代表宿主的主要抗體反應(yīng)(中和抗體代表宿主的次要抗體反應(yīng))。二、上海兒童抗-腸病毒VP1非中和抗體反應(yīng)特點(diǎn)的研究應(yīng)用重疊延伸PCR方法體外合成和逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲得來自EV-A(種)的EV71和CA16、EV-B的CB3、EV-C的PV1(human poliovirus1)和RV-A(rhinovirus,RV)的RV13(human rhinovirus A13)VP1的基因序列,構(gòu)建p ET-21b-EV71 VP1、p ET-21b-CA16 VP1、p ET-21b-CB3 VP1、p ET-21b-PV1VP1和p ET-21b-RV13 VP1的原核表達(dá)載體,表達(dá)并純化重組目的蛋白。應(yīng)用NEIBM-ELISA和競爭ELISA檢測364份上海市非HFMD兒童門診血清標(biāo)本(8個(gè)年齡段:28d、1-6m、6m-12m、12m-24m、24m-36m、36m-48m、48m-60m和60m-72m)抗-5個(gè)腸病毒VP1非中和抗體反應(yīng)水平;篩選獲得各腸病毒抗-VP1高反應(yīng)血清抗體,競爭ELISA進(jìn)一步檢測不同腸病毒抗-VP1非中和抗體反應(yīng),并將抗體反應(yīng)性及競爭抑制反應(yīng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同腸病毒非中和抗體反應(yīng)隨年齡呈現(xiàn)與中和抗體相似的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律:新生兒(28d)出生時(shí)即存在高水平的腸病毒VP1非中和抗體,隨后逐漸消退,1-12m降至最低點(diǎn)后不斷上升,48-60m達(dá)到峰值,60-72m明顯下降(RV13除外)。根據(jù)此變化規(guī)律,將此動(dòng)態(tài)分為3個(gè)階段(28d、1-12m和12-72m)進(jìn)行5個(gè)腸病毒VP1非中和抗體反應(yīng)水平和競爭抑制水平的分析比較,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)性和競爭抑制水平在28d與12-72m顯示明顯的層級(jí):RV13CB3PV1CA16EV71。5種VP1抗體反應(yīng)性的相關(guān)性在12-72m顯示3個(gè)層次:EV-A種之間最高(EV71和CA16),EV-A、B、C(腸道傳播病毒種)之間次之,RV13與EV-A、B、C(腸道傳播病毒種與呼吸道傳播病毒種)之間最低,反應(yīng)相關(guān)性在1-28d時(shí)顯示出與在12-72 m大致相似的趨勢。5種腸病毒VP1競爭抑制的相關(guān)性與與VP1序列同源性無關(guān),在28d和12-72m兩個(gè)年齡段相差較大,12-72m年齡段較28d顯著下降。這些結(jié)果提示,28d的新生兒腸病毒的非中和抗體代表母體轉(zhuǎn)運(yùn)的Ig G水平,1-12m主要反應(yīng)母體非中和抗體水平消退至最低點(diǎn)并開始進(jìn)入原發(fā)感染期,12-72m主要反應(yīng)腸病毒原發(fā)感染期的狀況。母體Ig G(28d)與原發(fā)感染期(12-72m)腸病毒的非中和抗體水平和競爭抑制水平均顯示明顯的層級(jí):經(jīng)呼吸道傳播的腸病毒RV-A(RV13)非中和抗體反應(yīng)水平高于腸道傳播的腸病毒,腸道傳播的病毒EV-B(CB3)高于EV-C(PV1)高于EV-A,EV-A內(nèi)CA16明顯高于EV71。抗-各種腸病毒VP1在12-72m和28d兩個(gè)年齡段反應(yīng)相關(guān)性與其VP1序列的同源性大致相符,競爭抑制的相關(guān)性則明顯受序列同源性和抗體水平二者的影響。不同腸病毒抗-VP1競爭抑制水平及其相關(guān)系數(shù)在28d和12-72m兩個(gè)年齡段的差別反映了成年母體與原發(fā)感染期非中和抗體反應(yīng)的不同。三、不同的抗-CA16 VP1非中和抗體反應(yīng)的發(fā)現(xiàn):特異性或非特異性的抗體反應(yīng)在全基因合成的CA16 VP1-p MD-18T質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,通過PCR方法獲得CA16VP1全長及截短體抗原(p ET-21b-CA16 VP1、p ET-32a-VP141-297、p ET-32a-VP161-297、p ET-32a-VP11-60、p ET-32a-VP145-58)的DNA序列,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒,原核表達(dá)并純化目的蛋白。應(yīng)用NEIBM-ELISA和競爭ELISA的方法分析上海獻(xiàn)血員和山西老年人兩種人群血清抗-CA16 VP1非中和抗體反應(yīng)水平,應(yīng)用CA16 VP1全長及截短體抗原對(duì)上述高反應(yīng)血清進(jìn)行NEIBM-ELISA檢測,并用不同CA16 VP1截短體與全長VP1競爭結(jié)合兩種人群高反應(yīng)血清抗-CA16 VP1抗體,并將抗體反應(yīng)性及競爭抑制反應(yīng)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異和相關(guān)性分析;同時(shí)測定兩種人群不同競爭抑制類型抗-CA16中和抗體效價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上海人群中抗-CA16 VP141-297抗體反應(yīng)性顯著高于VP161-297,且所有基于CECRS的抗原(VP11-297、VP141-297、VP11-60和VP145-58)對(duì)CA16 VP1的競爭抑制水平明顯高于VP161-297;山西人群中,盡管抗-CA16 VP141-297的抗體反應(yīng)性水平與VP161-297無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但VP141-297對(duì)CA16 VP1的競爭抑制水平顯著地高于VP161-297。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),上海人群CA16各抗原抗體反應(yīng)性的相關(guān)性和對(duì)全長VP1的抑制率的相關(guān)水平顯著高于山西人群。基于VP11-60和VP141-297對(duì)CA16VP1在兩種人群中顯示不同的抑制水平,我們將兩種人群抗-CA16 VP1的抗體反應(yīng)分為11個(gè)抑制類型;上海獻(xiàn)血員包含6種抑制類型,并出現(xiàn)1優(yōu)勢類型,占71.4%,顯示為特異的競爭抑制類型;山西老年人共有9種抑制類型,無明顯的優(yōu)勢類型,比例最高的競爭類型僅占28.3%,特異的競爭抑制類型僅占6.5%;上海獻(xiàn)血員中特異抑制類型的中和抗體滴度明顯高于其它抑制類型。結(jié)果提示,上海獻(xiàn)血員抗-CA16 VP1非中和抗體反應(yīng)與EV71相似,也主要針對(duì)基于CECRS的抗原。兩種人群存在不同的抗-CA16 VP1的抗體反應(yīng)和競爭抑制模式,上海獻(xiàn)血員CA16 VP1各抗原反應(yīng)相關(guān)性明顯高于山西老年人,且各抗原抑制相關(guān)性也普遍明顯高于山西老年人,顯示抗-CA16 VP1抗體反應(yīng)的一致性,提示上海獻(xiàn)血員存在特異的抗-CA16抗體反應(yīng)。上海獻(xiàn)血員抗-CA16 VP1抗體反應(yīng)出現(xiàn)優(yōu)勢競爭抑制類型,其中和抗體效價(jià)明顯高于其他類型,符合特異抗體反應(yīng)特性,為特異的CA16病毒感染所引起,山西老年人則顯示出是由其它腸病毒感染引起的的非特異抗-CA16抗體反應(yīng)特點(diǎn)。另外,抗-CA16 VP141-297與抗-CA16 VP11-297等反應(yīng)相關(guān)系數(shù)和的競爭抑制相關(guān)系數(shù)的差異可用來提示不同人群CA16特異感染的流行水平。這些發(fā)現(xiàn)能夠幫助理解宿主抗-CA16和其它腸病毒感染的體液免疫反應(yīng)特點(diǎn),并有助于找到有效的評(píng)估CA16及其相關(guān)腸病毒感染血清流行病學(xué)檢監(jiān)測的方法。四、非中和抗體反應(yīng)在小鼠上的誘導(dǎo)及其對(duì)中和抗體反應(yīng)影響的研究原核表達(dá)和純化p ET21b-EV71、p ET21b-CA16、p ET21b-CA5、p ET21b-CA6、p ET21b-CA10、p ET21b-CB3、p ET21b-PV1和p ET21b-RV13等腸病毒的VP1抗原;設(shè)計(jì)各種方案,應(yīng)用不同腸病毒VP1(除EV71 VP1或CA16 VP1外)交叉接種小鼠(交叉組),構(gòu)建腸病毒交叉免疫模型以模擬人群非中和抗體反應(yīng)情況,同時(shí)設(shè)置EV71 VP1(EV71組)或CA16 VP1(CA16組)接種組和陰性對(duì)照組,收集各免疫階段的血清標(biāo)本;表達(dá)純化EV71和CA16 VP1的核心抗原、N抗原、C抗原、非CECRS抗原及全長VP1抗原,對(duì)上述血清標(biāo)本進(jìn)行ELISA和競爭ELISA分析,測定針對(duì)EV71 VP1和CA16 VP1各抗原抗體的動(dòng)態(tài)變化情況,探討以交叉反應(yīng)為特征的腸病毒非中和抗體反應(yīng)可能的形成機(jī)制及變化特點(diǎn)。在上述研究基礎(chǔ)上,制備不包含EV71 VP1或CA16 VP1免疫的兩種小鼠腸病毒交叉免疫模型,分別對(duì)上述小鼠模型及未進(jìn)行交叉免疫接種的陰性對(duì)照和EV71 VP1或CA16 VP1免疫組小鼠接種EV71或C A1滅活6疫苗,收集接種前及接種后不同時(shí)期的小鼠血清,測定EV71實(shí)驗(yàn)組抗-EV71中和效價(jià)和CA16實(shí)驗(yàn)組抗-CA16中和抗體效價(jià)及其持續(xù)時(shí)間,探討非中和抗體對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的影響。通過不同腸病毒VP1蛋白免疫構(gòu)建小鼠腸病毒交叉免疫模型,發(fā)現(xiàn)隨著不同VP1交叉接種次數(shù)的增加,EV71交叉組抗-EV71 VP11-60反應(yīng)性逐漸趕上并超過VP161-297,VP141-297反應(yīng)性逐漸趕上VP11-297,EV71 VP1抗體反應(yīng)向CECRS表位偏移。EV71組,抗-EV71抗體反應(yīng)性與VP1抗原長度成比例,未出現(xiàn)向CECRS表位偏移。競爭ELISA也顯示EV71交叉組包含C ECRS的EV71 VP1抗原能較好的抑制抗-EV71 VP1非中和抗體反應(yīng)。不同VP1分別對(duì)EV71交叉組和EV71組小鼠抗-EV71 VP1和抗-CA16 VP1的4種競爭抑制模式顯示出各自的特點(diǎn),在上海市28d兒童各種腸病毒VP1的競爭抑制反應(yīng)中出現(xiàn)了分別與4種競爭抑制模式相對(duì)應(yīng)的情況。上述結(jié)果提示,腸病毒VP1蛋白交叉免疫小鼠可成功誘導(dǎo)出與人群中相似的非中和抗體反應(yīng),提示某種腸病毒感染誘導(dǎo)的抗-VP1反應(yīng)可形成對(duì)其他腸病毒VP1的交叉反應(yīng),多種腸病毒的感染可導(dǎo)致非中和抗體反應(yīng)向CECRS表位偏移。在已構(gòu)建測的小鼠腸病毒交叉免疫模型的基礎(chǔ)上,將EV71交叉組、EV71組和陰性對(duì)照組三組小鼠再接種兩次EV71滅活疫苗,抗-EV71中和抗體測定結(jié)果顯示,疫苗免疫后不同時(shí)間段內(nèi),EV71交叉組小鼠的抗-EV71中和抗體的水平和持續(xù)時(shí)間與陰性對(duì)照組并無顯著差異。在CA16交叉組、CA16組和陰性對(duì)照組中,CA16疫苗首次免疫后,三組小鼠中和抗體水平相似且無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;CA16疫苗二次免疫后,三組小鼠血清抗-CA16中和抗體水平均提高,且陰性對(duì)照組小鼠血清中和抗體水平出現(xiàn)高于CA16交叉組和CA16組的趨勢,CA16交叉組中和抗體水平出現(xiàn)低于CA16組的趨勢。上述結(jié)果提示,以交叉反應(yīng)為主的非中和抗體的存在對(duì)后續(xù)EV71感染誘導(dǎo)中和抗體反應(yīng)沒有影響,但對(duì)CA16感染誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體可能有一定的影響�？偨Y(jié):本研究我們首次發(fā)現(xiàn)了主要針對(duì)CECRS表位的抗-EV71 VP1抗體反應(yīng),提出人腸病毒非中和抗體反應(yīng)的概念。檢測發(fā)現(xiàn)正常成人、老年人、手足口病患兒和不同年齡段兒童等各類人群中普遍存在各腸病毒抗-VP1非中和抗體反應(yīng)。首次在嬰幼兒中系統(tǒng)、全面地觀察到從出生到6歲時(shí)與中和抗體相似的各腸病毒抗-VP1非中和抗體反應(yīng)的動(dòng)態(tài)變化過程,提出了母體轉(zhuǎn)移Ig G抗體反應(yīng)和原發(fā)感染抗體反應(yīng)概念。在小鼠模型上可成功誘導(dǎo)出與人群中的非中和抗體反應(yīng)相似的抗-EV71 VP1/CA16的非中和抗體反應(yīng),發(fā)現(xiàn)了多種腸病毒感染導(dǎo)致非中和抗體反應(yīng)向CECRS表位偏移的人腸病毒非中和抗體反應(yīng)可能的形成機(jī)制。在小鼠模型中觀察到,非中和抗體的存在可能會(huì)對(duì)EV71和CV16疫苗誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生不同影響的線索。通過這些研究,我們獲得腸病毒非中和抗體反應(yīng)比較全面系統(tǒng)的信息,補(bǔ)充我們對(duì)腸病毒宿主體液免疫反應(yīng)的認(rèn)知,幫助進(jìn)一步深入、全面理解腸病毒與宿主相互作用規(guī)律,提高腸病毒感染的防控水平,同時(shí)也可為腸病毒感染抗體檢測及流行病學(xué)監(jiān)測方法的建立等研發(fā)提供重要病毒基礎(chǔ)免疫學(xué)數(shù)據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
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本文編號(hào)：2187420