【摘要】：水痘(varicella)是高度傳染性的兒童常見疾病,多發(fā)于2~6歲,冬春兩季多發(fā),其傳染力強,傳染源主要是患者,急性期患者的水痘內(nèi)容物及呼吸道分泌物內(nèi)均含有病毒。帶狀皰疹是一種常見于老年的急性感染性皮膚病,患者出現(xiàn)單側(cè)性皮疹,按神經(jīng)節(jié)段分布,伴有疼痛。本病春秋季節(jié)多見,發(fā)病率隨年齡增大而呈顯著上升。水痘與帶狀皰疹,雖然是兩種不同的疾病,但卻是由同一種病原體所引起,即水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)。VZV在人體初次感染時引起水痘,恢復后病毒潛伏在體內(nèi),可長期潛伏于脊髓神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元內(nèi),在人體免疫力低下時復發(fā)引起帶狀皰疹,故被稱為水痘-帶狀皰疹病毒。在中國,VZV的感染十分普遍,據(jù)統(tǒng)計在45歲以上人群中90%都是病毒的感染者或攜帶者。目前現(xiàn)有的疫苗分為兩類:預防水痘的初次感染的疫苗被稱為水痘疫苗,這類疫苗多是對兒童或者青年使用達到預防效果;預防病毒的復發(fā)的疫苗被稱為帶狀皰疹疫苗,多對老年人使用。目前使用較普遍的這兩類疫苗都是以減毒株VZV作為免疫原,針對不同的免疫目的,采用不同的配方和佐劑制成。這兩類疫苗雖然都具有一定的保護效果,但都存在著病原體清除不徹底,細胞免疫應答低下等不足,為病毒的后續(xù)復發(fā)埋下隱患。gE蛋白(envelope glycoprotein E,gE)是VZV表面7種膜蛋白中的一種,在病毒感染以及傳播過程中發(fā)揮重要的作用,研究顯示,gE是病毒膜蛋白中最具有免疫原性的一個。但是目前基于gE蛋白構(gòu)建的疫苗往往都只具有較強的體液免疫反應,而無法誘導較強的細胞免疫。前面說到VZV具有潛伏性,在人體免疫力低下的時候造成復發(fā)。因此對于VZV的預防,體液免疫與細胞免疫的雙重保護很重要,其中細胞免疫更是尤為重要。為了使構(gòu)建的疫苗在誘導體液免疫的同時也能產(chǎn)生相應的細胞免疫效果,我們在以gE為免疫原的基礎上使用了DNA疫苗的形式,目的是為了增強疫苗誘導細胞免疫的能力,并引入了VZV的另一個蛋白——IE63蛋白(immediate early protein 63,IE63)。IE63蛋白是VZV早期復制所必須的一個功能性蛋白,病毒感染細胞后會大量表達IE63,同時IE63也是病毒在潛伏狀態(tài)下唯一一個仍然高表達的蛋白。因此,針對IE63蛋白的疫苗有望引起較強的細胞免疫,并有望清除潛伏病毒。本文構(gòu)建的DNA疫苗在pcDNA3.1質(zhì)粒上插入外源片段gE和IE63序列,一共構(gòu)建了3個重組質(zhì)粒,3個重組質(zhì)粒均能同時表達gE蛋白與IE63蛋白。以CpG寡聚脫氧核苷酸1826(CpG-ODN1826)為佐劑,對BALB/c小鼠進行腿部肌肉注射,經(jīng)過3次免疫后,結(jié)果顯示小鼠血液中產(chǎn)生了較強的gE特異性IgG抗體水平,通過對IgG抗體的亞型分析,以及對小鼠脾臟細胞干擾素γ分泌情況分析,結(jié)果顯示我們構(gòu)建的疫苗在誘導較強的體液免疫的同時也產(chǎn)生了相應的的T細胞免疫應答。通過本文的研究,我們驗證了gE和IE63作為VZV重要抗原的地位。DNA疫苗形式很好的誘導了一種平衡性的細胞—體液免疫。對于水痘-帶狀皰疹的治療與預防,提供了一種既注重防御病毒初次感染(抗體水平)又預防病毒復發(fā)(細胞免疫)的保護策略。同時,在疫苗設計中,對于體液—細胞平衡免疫的誘導,本文的做法也提供了一種可借鑒的思路。
[Abstract]:Chicken pox (varicella) is a common disease of highly contagious children. It often occurs in the age of 2~6. In the two quarter of winter and spring, the infectious force is strong. The infectious source is mainly the patient. The virus in the contents of chickenpox and the respiratory secretions in the acute period are all containing the virus. According to the ganglion segment distribution and pain, this disease is common in the spring and autumn season, and the incidence of the disease increases with age. The varicella and herpes zoster, although it is two different diseases, is caused by the same pathogen, that is, the varicella zoster virus (varicella-zoster virus, VZV).VZV causes chickenpox in the first infection of the human body. The retrovirus lurks in the body and can lurk in the neurons of the dorsal root ganglion of the spinal cord for a long time. It is known as varicella zoster virus in the low immunity of the human body. In China, the infection of VZV is very common. According to statistics, 90% of the people over 45 years old are the infected or carriers of the virus. The vaccine is divided into two categories: vaccines to prevent initial infection of chickenpox are called varicella vaccines. These vaccines are mostly used for children or young people to achieve preventive effects; the vaccine to prevent the recurrence of the virus is called herpes zoster vaccine and is used for older people. The two types of vaccines are currently used as immunogens with the strain VZV. According to different immunological purposes, different formulations and adjuvant are made. Although these two kinds of vaccines have certain protective effects, there are not thorough pathogen clearance, low cellular immune response and so on, and the hidden hidden danger.GE protein (envelope glycoprotein E, gE) is one of the 7 membrane proteins on the surface of VZV. Species, which play an important role in viral infection and transmission, have shown that gE is one of the most immunogenic in viral membrane proteins. However, the current vaccines based on gE protein often have strong humoral immune responses and can not induce strong cellular immunity. In the previous study, the VZV is latent and is immune to human immunity. Therefore, the double protection of humoral and cellular immunity is very important for the prevention of VZV, and the cellular immunity is particularly important. In order to induce the vaccine to induce humoral immunity, it can also produce the corresponding cellular immune effect. We use the DNA vaccine on the basis of gE as the immunogen. Form, the purpose is to enhance the ability of vaccine to induce cell immunity, and to introduce another protein of VZV - IE63 protein (immediate early protein 63, IE63).IE63 protein is a functional protein necessary for the early replication of VZV, and the virus infected cells will express IE63 in large amount, and IE63 is the only one of the virus in the latent state. It is still highly expressed protein. Therefore, the vaccine against IE63 protein is expected to cause strong cellular immunity, and is expected to clear the latent virus. The DNA vaccine constructed in this paper is inserted into the pcDNA3.1 plasmid by inserting exogenous fragment gE and IE63 sequence. Altogether 3 recombinant plasmids are constructed, and all 3 recombinant plasmids can simultaneously express gE protein and IE63 protein. CpG oligosaccharide oligoplasmids can be expressed simultaneously. Polydeoxynucleotides 1826 (CpG-ODN1826) was used as an adjuvant to injecting the leg muscles of BALB/c mice. After 3 immunizations, the results showed that a strong gE specific IgG antibody level was produced in the blood of the mice. The analysis of the subtype of IgG antibody and the analysis of the secretion of the interferon gamma in the spleen cells of the mice showed that the disease was constructed. The vaccine produced a corresponding T cell immune response while inducing strong humoral immunity. Through this study, we verified that the status of gE and IE63 as an important VZV antigen in the form of.DNA vaccine has induced a balanced cell humoral immunity. It provides a kind of treatment and prevention for varicella and herpes zoster. The protection strategy of defending the first infection of the virus (the level of the antibody) and preventing the recurrence of the virus (cell immunity) is also emphasized. Meanwhile, in the design of the vaccine, the practice of this paper also provides a useful way of thinking for the induction of the balance immunity of the body fluid to the cell.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392

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