【摘要】：近幾十年來,隨著免疫缺陷人群的不斷擴大,侵襲性真菌感染呈逐年上升的趨勢。目前,引起廣泛關注的致病真菌主要有白念珠菌,隱球菌和煙曲霉,其中煙曲霉是導致侵襲性肺曲霉病的元兇。煙曲霉是一種腐生型的真菌,其分布廣,產(chǎn)孢強,在環(huán)境中無處不在。由于煙曲霉孢子直徑較小,其很容易被人體吸入肺中。對于正常的人體來說,吸入的孢子很容易被殺滅并清除。但是對于免疫缺陷的患者來說,煙曲霉經(jīng)呼吸道侵染后,體內的免疫細胞若不能及時將其清除,這些逃脫免疫的孢子會在患者體內萌發(fā)、繁殖,進而導致侵襲性曲霉病。目前臨床上主要的抗真菌藥物有伊曲康唑,伏立康唑,兩性霉素B以及卡泊芬凈等。然而,這些藥物都有其局限性,其中兩性霉素對宿主的副作用較大;卡泊芬凈的抗菌譜窄;而運用最廣泛的伊曲康唑和伏立康唑則很容易產(chǎn)生耐藥性。因此,開發(fā)抗菌活力強,抗菌范圍廣以及毒副作用小的新型抗真菌藥物成為了當務之急,而重中之重是尋找合適的藥靶。鐵離子作為一種重要的微量元素參與了一系列的生物學過程。由于宿主體內的鐵多以血紅蛋白以及乳鐵蛋白等形式存在,游離的鐵濃度很低,病原菌如何成功地從宿主體內獲取鐵元素是其致病的關鍵。因此,病原菌中調控鐵離子吸收以及平衡的因子經(jīng)常也是毒力決定子,然而鐵離子平衡調控有關的機制在煙曲霉中仍知之甚少。本研究論文以煙曲霉為研究材料,利用基因敲除等手段,對煙曲霉中與鐵離子代謝以及毒性都相關的功能基因leuB和mrsA開展了系統(tǒng)的研究,得到了以下結論:1、證實轉錄因子LeuB不僅調控煙曲霉亮氨酸的合成,同時也調控鐵離子吸收。leuB的缺失會顯著降低與鐵載體合成、轉運相關基因(sidG,sit1和mirB)的轉錄以及低鐵載體的產(chǎn)生水平,從而影響煙曲霉在低鐵環(huán)境下生長。雙缺leuB和控制鐵離子吸收的轉錄因子hapX,會加劇ΔleuB對低鐵敏感的表型;而雙缺leuB和抑制鐵離子吸收的轉錄因子sreA,則會恢復ΔleuB對低鐵敏感的表型。這些結果均說明亮氨酸合成調控因子LeuB參與煙曲霉鐵離子吸收調控。2、低鐵環(huán)境下,leuB的缺失會導致細胞鐵離子吸收降低,leuA轉錄下調,進而阻礙亮氨酸的合成。而亮氨酸合成的阻斷會使蛋白酶體活力增強從而導致蛋白全局性降解。進一步研究證明LeuB的DNA結合結構域(Zn(Ⅱ)2Cys6)以及其C端對煙曲霉適應低鐵環(huán)境以及維持蛋白穩(wěn)定等發(fā)面發(fā)揮著重要作用。3、證實線粒體鐵通道m(xù)rsA的缺失會降低煙曲霉適應低鐵以及高鐵環(huán)境的能力。同時,mrsA缺失也會導致sreA轉錄低調,而受SreA抑制的和鐵離子吸收相關的基因如sidA,mirB,ftrA以及fetC則明顯高調。這些結果說明,MrsA是煙曲霉調控胞內鐵離子平衡必需的。4、進一步研究發(fā)現(xiàn)mrsA的缺失提高了煙曲霉對氧化應激以及唑類藥物的敏感性,其原因主要是ΔmrsA中ROS積累所致。位點突變實驗證實,MrsA中第38,96以及214位保守的組氨酸位點是煙曲霉應對高鐵,低鐵,氧化應激以及唑類藥物等環(huán)境所必需的。5、小鼠毒性實驗證明煙曲霉中和鐵離子代謝相關的功能基因leuB以及mrsA都是維持煙曲霉毒力所必需的。綜上所述,本研究闡明了煙曲霉功能基因leuB和mrsA調控鐵離子平衡的相關機制;同時也證明了 LeuB和MrsA均和煙曲霉毒力相關,為將來的抗真菌治療提供了理論支持。
[Abstract]:In recent decades, with the continuous expansion of immune deficiency population, invasive fungal infection has been increasing year by year. At present, the main pathogenic fungi are Candida albicans, Cryptococcus and Aspergillus fumigatus, among which Aspergillus fumigatus is the leading cause of invasive pulmonary aspergillosis. Aspergillus fumigatus is a saprophytic fungus with wide distribution and sporulation. Strong, ubiquitous in the environment. As Aspergillus fumigatus is small in diameter, it is easy to be inhaled in the lungs. For normal human body, the inhaled spores are easily killed and removed. But for the immune deficiency patients, the immune cells in the body can not be removed in time after the infection of the respiratory tract. The degenerated spores will germinate and reproduce in the patients and lead to invasive aspergillosis. The main antifungal drugs are itraconazole, voriconazole, amphotericin B and caspofungin. However, these drugs have their limitations, of which amphotericin has a larger side effect on the host; and the antimicrobial spectrum of caspofungin is narrow; and The use of the most widely used itraconazole and voriconazole is easy to produce resistance. Therefore, the development of a new antifungal agent with strong antibacterial activity, wide antibacterial range and small side effects has become a top priority and the most important is to find the appropriate drug target. Iron is a major trace element involved in a series of biological activities. Because the iron in the host is mostly in the form of hemoglobin and lactoferrin, the concentration of free iron is very low, how the pathogenic bacteria obtain iron elements from the host is the key to its pathogenesis. Therefore, the factors regulating the absorption and balance of iron ions in the pathogenic bacteria are often also the virulence determinants, however, the iron ion balance regulation The related mechanisms are still very little known in Aspergillus fumigatus. This paper studies Aspergillus fumigatus as a material, using gene knockout and other means to study the functional genes related to iron ion metabolism and toxicity in Aspergillus fumigatus, leuB and mrsA. The following conclusions are obtained: 1, the transcriptional factor LeuB not only regulates Aspergillus fumigatus leucine. The synthesis, but also the regulation of the loss of iron ion absorption.LeuB can significantly reduce the iron carrier synthesis, the transcription of transport related genes (sidG, sit1 and mirB) and the production level of the low iron carrier, thus affecting the growth of Aspergillus fumigatus in the low iron environment. Double deficiency leuB and the control of the transcription factor hapX, which control the absorption of iron ions, will aggravate the sensitivity of the delta leuB to the low iron. The phenotypes, while double deficiency of leuB and the transcription factor sreA that inhibit the absorption of iron ions, will restore the delta sensitive phenotype of the low iron. These results suggest that the bright ammonia synthesis regulator LeuB participates in the regulation of.2 of the iron ion absorption of Aspergillus fumigatus, and the absence of leuB in the low iron environment leads to the decrease in the absorption of iron ions in the cells, the downregulation of leuA transcripts and the hindering the brightness of the leuA. The blocking of leucine synthesis can enhance the activity of the proteasome and lead to the global degradation of the protein. Further studies have shown that the DNA binding domain of LeuB (Zn (II) 2Cys6) and its C terminal play an important role in the.3 of the Aspergillus fumigatus to the low iron environment and the maintenance of protein stability, confirming the mrsA of the mitochondrial iron channel. Deletion can reduce the ability of Aspergillus fumigatus to adapt to the low iron and high iron environment. At the same time, the deletion of mrsA can also lead to the low modulation of sreA transcription, while the genes related to SreA inhibition and iron absorption, such as sidA, mirB, ftrA and fetC, are obviously high. These results suggest that MrsA is the necessary.4 for the balance of iron ions in Aspergillus fumigatus. The absence of mrsA increases the sensitivity of Aspergillus fumigatus to oxidative stress and azolic drugs. The reason is mainly due to the accumulation of ROS in the delta mrsA. The site mutation test confirmed that the 38,96 and 214 conservative histidine loci in MrsA are essential for the.5 of Aspergillus fumigatus to respond to the environment of high iron, low iron, oxidative stress and azole, and the toxicity of mice. The experimental results show that the functional genes leuB and mrsA related to the neutralization of Aspergillus fumigatus and iron ions are essential for the maintenance of Aspergillus fumigatus virulence. To sum up, this study illustrates the related mechanisms of the regulation of iron ion balance by Aspergillus fumigatus functional gene leuB and mrsA, and also shows that both LeuB and MrsA are associated with Aspergillus fumigatus virulence, for future antifungal treatment. The treatment provides theoretical support.
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R379

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本文編號：2157610