發(fā)布時(shí)間：2018-07-14 18:31

【摘要】：Siglec-9屬于免疫球蛋白超家族的成員,歸屬于CD33相關(guān)的Siglec,通過識別含有唾液酸的糖鏈結(jié)構(gòu),在細(xì)胞增殖、活化以及凋亡和自噬方面發(fā)揮重要作用,同時(shí)參與調(diào)控機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫。Siglec-9主要表達(dá)于免疫細(xì)胞,如中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,在淋巴細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上也可表達(dá)。膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征,細(xì)菌內(nèi)毒素刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性因子,引起機(jī)體的抗炎因子和促炎因子失衡,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致膿毒性休克和多器官功能衰竭。本課題主要是通過基因工程技術(shù),制備、表達(dá)抗Siglec-9Fab段,并對其進(jìn)行生物特性鑒定,通過體外活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討該抗體在炎癥方面發(fā)揮的作用。研究方法:1.制備抗Siglec-9抗體Fab利用前期篩選得到的陽性噬菌體,通過PCR技術(shù)擴(kuò)增抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH),經(jīng)測序得到核酸和氨基酸序列并與數(shù)據(jù)庫比對。根據(jù)核酸序列設(shè)計(jì)引物,通過重疊延伸PCR技術(shù)將抗體輕鏈恒定區(qū)(CL)和重鏈恒定區(qū)(CH1)分別與輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)連接,獲得重組輕鏈(L)和重鏈(Fd)。經(jīng)過限制性核酸內(nèi)切酶酶切,L和Fd與表達(dá)載體pETDUET-1連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pETDUET-1-Fab。將重組質(zhì)粒pETDUET-1-Fab轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21,加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá),經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)得到抗Siglec-9抗體Fab段。2.抗Siglc-9抗體Fab段與抗原結(jié)合能力的鑒定和抗體親和力分析采用SDS-PAGE和Western blot鑒定抗Siglec-9抗體Fab段,ELISA、流式細(xì)胞儀和Biacore X100分別檢測抗Siglec-9抗體Fab與Siglec-9的特異性結(jié)合能力和抗體的親和力。3.抗Siglec-9抗體Fab的體外實(shí)驗(yàn)抗Siglec-9抗體Fab作用于THP-1細(xì)胞分化的巨噬細(xì)胞和人單核外周血單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞,通過Q-PCR和ELISA分別檢測炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量,通過Western blot檢測TLR4信號通路上蛋白磷酸化水平的變化。研究結(jié)果:1.通過PCR技術(shù)成功擴(kuò)增抗體可變區(qū),經(jīng)測序驗(yàn)證未產(chǎn)生無功能基因或發(fā)生基因突變,利用重疊延伸PCR技術(shù)連接抗體的可變區(qū)和恒定區(qū),得到重組重鏈Fd和輕鏈L,重組原核系統(tǒng)表達(dá)質(zhì)粒pETDUET-1-Fab成功構(gòu)建。轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21表達(dá),經(jīng)蛋白純化系統(tǒng)純化得到抗Siglec-9抗體Fab。2.SDS-PAGE和Western blot結(jié)果顯示抗Siglec-9抗體Fab主要表達(dá)于上清中,分子量約27KD。ELISA、流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示抗Siglec-9抗體Fab特異性結(jié)合Siglec-9。Biacore X100檢測得親和常數(shù)為6.58×10~(-7)。3.Q-PCR和ELISA顯示抗Siglec-9抗體Fab可有效的抑制促炎性細(xì)胞因子和促進(jìn)抑炎性細(xì)胞因子的表達(dá)量,Western blot顯示抗Siglec-9抗體Fab可抑制TLR4信號通路上蛋白的磷酸化水平。研究結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研究成功制備抗Siglec-9抗體Fab段,該抗體特異性結(jié)合Siglec-9,并具有較高的親和力,體外實(shí)驗(yàn)研究表明可明顯抑制促炎性細(xì)胞因子IFN-β、TNF-α、IL-1β、IL-6和促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量,并且可抑制TLR4信號通路上蛋白的磷酸化,發(fā)揮抗炎保護(hù)作用。本研究通過基因工程得到的單克隆抗體,可能成為新的預(yù)防和治療炎性相關(guān)疾病的方法。
[Abstract]:The recombinant plasmid pETDUET - 1 - Fab was cloned into E . coli BL21 . The recombinant plasmid pETDUET - 1 - Fab was amplified by PCR . TNF - 偽 , IL - 1尾 , IL - 6 and pro - inflammatory cytokines IL - 10 mRNA levels and protein level expression levels , and can inhibit the phosphorylation of protein on the signaling pathway , and exert anti - inflammatory protective effect . The monoclonal antibody obtained by genetic engineering may be a new method to prevent and treat inflammatory related diseases .
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 姜晶;孫穎;劉紅艷;牟玲;羅恩杰;;人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因引物設(shè)計(jì)方法的改良[J];微生物學(xué)雜志;2012年02期

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本文編號：2122582