本文選題：液相色譜-質(zhì)譜 + 適配體��； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：DNA或RNA適配體具有選擇性識別病變細胞的能力,在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和疾病早期診斷方面顯示了應(yīng)用潛力。目前的研究表明:適配體是通過與細胞表面特異性蛋白的結(jié)合來實現(xiàn)對細胞的分辨。然而由于適配體與細胞表面靶標(biāo)蛋白之間的作用力往往很弱,因此精準(zhǔn)鑒定適配體的結(jié)合蛋白仍然非常困難,已成為瓶頸問題之一,迫切需要發(fā)展高靈敏的分析方法。組蛋白翻譯后修飾(Histone Post-translational modifications,HPTMs)可以通過招募結(jié)合蛋白及復(fù)合物調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。最近研究發(fā)現(xiàn):臨近的組蛋白修飾具有協(xié)調(diào)或拮抗的作用,改變與結(jié)合蛋白的作用,從而影響轉(zhuǎn)錄。然而多種修飾介導(dǎo)的蛋白作用的表征和檢測非常困難,國際上一直缺乏有效的分析手段。針對以上問題,我們提出“發(fā)展鑒定結(jié)合蛋白的高靈敏分析方法”。本文分別以適配體、修飾多肽為誘餌,構(gòu)建了基于DNA模板和光交聯(lián)技術(shù)的分子探針,聯(lián)合生物質(zhì)譜技術(shù),分別建立了適配體識別蛋白和組蛋白多修飾結(jié)合蛋白的高靈敏分析方法。研究內(nèi)容主要分為以下兩個部分:第一部分:基于DNA模板化學(xué)和光交聯(lián)技術(shù),利用核酸適配體的識別特性,以溶菌酶為模型,設(shè)計了一種核酸適配體分子探針,用于研究目標(biāo)蛋白溶菌酶的選擇性標(biāo)記和富集。一方面,探針可將較弱的“核酸-蛋白”分子間作用轉(zhuǎn)化為共價鍵合,提高了適配體結(jié)合蛋白的捕獲;另一方面,將交聯(lián)劑固載在另一條獨立的單鏈DNA上,從而降低了以往交聯(lián)劑對適配體與結(jié)合蛋白專一性識別的干擾。在優(yōu)化的條件下,探針對溶菌酶顯示出高靈敏性和高選擇性的標(biāo)記和富集,實現(xiàn)了復(fù)雜背景下以及實際樣品中對目標(biāo)蛋白的標(biāo)記和富集,并通過質(zhì)譜進行了鑒定。實驗結(jié)果顯示這一新方法在發(fā)現(xiàn)適配體結(jié)合蛋白方面具有潛力。第二部分:基于多肽修飾識別、DNA自組裝和親和光交聯(lián)技術(shù),我們設(shè)計了多肽探針,探索多種修飾介導(dǎo)的結(jié)合蛋白分析新方法,并以此研究了組蛋白H3T3(蘇氨酸)磷酸化/H3K4(賴氨酸)三甲基與蛋白結(jié)構(gòu)域PHD的互作。實驗結(jié)果表明:H3T3磷酸化抑制了H3K4三甲基化對PHD的識別,從分析化學(xué)層面驗證了文獻報道的發(fā)現(xiàn)。我們的研究顯示:建立的方法可用于分析多種修飾介導(dǎo)下的結(jié)合蛋白,以及修飾間相互作用,在生物醫(yī)學(xué)中具有潛在應(yīng)用價值。
[Abstract]:DNA or RNA aptamers have the ability to selectively recognize diseased cells, and have shown potential application in the discovery of biomarkers and early diagnosis of diseases. Current studies have shown that aptamers can differentiate cells by binding to cell surface specific proteins. However, due to the weak interaction between aptamers and target proteins on cell surface, it is still very difficult to accurately identify the binding proteins of aptamers, which has become one of the bottleneck problems, and it is urgent to develop highly sensitive analytical methods. Histone Post-translational modifications (HPTMs) regulate gene transcription by recruiting binding proteins and complexes. Recent studies have found that adjacent histone modifications have coordinated or antagonistic effects, altering and binding proteins, thus affecting transcription. However, the characterization and detection of proteins mediated by various modifications are very difficult, and there has been a lack of effective analytical methods in the world. In view of the above problems, we proposed a highly sensitive method for the development and identification of binding proteins. In this paper, molecular probes based on DNA template and photocrosslinking technique were constructed with aptamer and modified polypeptide as bait respectively. A highly sensitive method for the analysis of aptamer recognition protein and histone multi-modified binding protein was established. The main contents are as follows: in the first part, based on DNA template chemistry and photocrosslinking technology, a novel aptamer molecular probe was designed based on the recognition characteristics of aptamer and lysozyme. It is used to study the selective labeling and enrichment of the target protein lysozyme. On the one hand, the probe can convert the weak "nucleic acid-protein" intermolecular interaction into covalent binding, which enhances the capture of aptamer binding proteins; on the other hand, the cross-linking agent is immobilized on another independent single-stranded DNA. Thus, the interference of previous crosslinking agents on the specificity recognition of aptamer and binding protein was reduced. Under the optimized conditions, the probe showed high sensitivity and high selectivity in labeling and enrichment of lysozyme. The target protein was labeled and enriched in complex background and in actual samples, and was identified by mass spectrometry. The results show that this new method has potential in the discovery of aptamer binding proteins. Part two: based on the techniques of polypeptide modification recognition DNA self-assembly and photocrosslinking we designed polypeptide probes and explored a variety of novel methods for the analysis of binding proteins mediated by modification. The interaction between histone H3T3 (threonine) phosphorylated / H3K4 (lysine) trimethyl and protein domain PhD was studied. The results showed that the phosphorylation of H _ 3T _ 3 inhibited the recognition of PhD by H _ 3K _ 4 trimethylation. Our results show that the proposed method can be used for the analysis of binding proteins mediated by various modifications and the interaction between modifications, and has potential application value in biomedicine.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R3416

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本文編號：2116967