本文選題：霍亂弧菌 + 埃爾托型�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio Cholerae, VC)引起的以急性水樣便為主要特征的腸道傳染病。在已發(fā)現(xiàn)的200多個霍亂弧菌血清群中,只有01群和0139群能夠引起霍亂的暴發(fā)和流行。自1817年以來,霍亂已經(jīng)引起了七次世界范圍的大流行,目前仍是我國一類防控的腸道傳染病。廣東省地處我國東南沿海地區(qū),與加爾各答、印度和孟加拉灣同處相同的緯度,是我國霍亂的流行高發(fā)地區(qū)。1961年7月,廣東省陽江縣報告了我國建國以來首起埃爾托霍亂疫情以來,開啟了我國霍亂第七次大流行的序幕,至2013年止,我省霍亂累計發(fā)病近80000例,死亡近2000人,嚴(yán)重影響和危害了人民健康,影響了生產(chǎn)、旅游、外貿(mào)、交通運(yùn)輸,甚至社會安定。霍亂腸毒素CT是霍亂弧菌最重要的致病因子,其編碼基因為ctxAB,是目前已知的致泄毒素中最強(qiáng)烈的毒素。攜帶ctxAB基因的霍亂弧菌稱為產(chǎn)毒株,是引起霍亂暴發(fā)流行的主要病原體,而不攜帶ctxAB基因的霍亂弧菌非產(chǎn)毒株對人不致病或偶然有些菌株引起腹瀉,一般不引起霍亂的暴發(fā)和流行。研究發(fā)現(xiàn),01群和0139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株的基因組相對比較保守,第七次霍亂世界大流行期間分離的01群埃爾托型霍亂弧菌產(chǎn)毒株的基因組僅存在細(xì)微的變化,這些變化隨時間的推移慢慢地累積,而01群和0139群非產(chǎn)毒株的基因組則表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。這些研究基礎(chǔ)將為我們進(jìn)一步使用更高分辨率的分子分型方法去研究霍亂弧菌產(chǎn)毒株的進(jìn)化和變異特征提供基礎(chǔ)。細(xì)菌分型是推斷菌株間關(guān)系的常用方法,可用于重新構(gòu)建種系進(jìn)化關(guān)系、描述菌群結(jié)構(gòu),也可以用于傳染病暴發(fā)的溯源分析。細(xì)菌分型早期主要依靠形態(tài)學(xué)方法,如血清分型、噬菌體分型、毒素分型及抗生素耐藥譜等。近年來,基于DNA序列分析的分子分型成為主要的技術(shù)。其中,脈沖場凝膠電泳技術(shù)(Pulsed field gel electrophoresis, PFGE)是當(dāng)前細(xì)菌分子分型的主流技術(shù),通過限制性內(nèi)切酶消化細(xì)菌基因組后產(chǎn)生的DNA指紋圖譜進(jìn)行暴發(fā)識別和溯源分析。此外,多位點(diǎn)序列分型(Multilocus sequence typing. MLST)和多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(Multilocus variable-number tandem repeat analysis, MLVA)等分子分型方法,通過互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫大大簡化和方便了不同實驗室間的數(shù)據(jù)交流與共享,有利于快速進(jìn)行大范圍的暴發(fā)調(diào)查和溯源分析。但是,這些分型方法僅反映了病原菌基因組的局部遺傳信息,分辨力有限,對于高度克隆化的菌株,或進(jìn)行大時間跨度的流行病學(xué)研究稍顯不足。全基因組測序(Whole-genome sequencing,WGS)分型,可在全基因組堿基序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行流行病學(xué)分析,全面反映了病原菌的遺傳與變異特征,大大提高了菌株進(jìn)化和溯源分析的分辨力,有助于快速地確認(rèn)并追蹤到病原體。上個世紀(jì)90年代開始,廣東省在霍亂防治中逐漸建立了核糖體分型、脈沖場凝膠電泳技術(shù)以及熒光聚合酶鏈反應(yīng)等分子生物學(xué)監(jiān)測技術(shù),主要用于探索在發(fā)生霍亂暴發(fā)疫情時,對病原體進(jìn)行快速鑒定和溯源分析。目前,尚未有研究對我省歷年霍亂弧菌的病原學(xué)分子特征進(jìn)行全面的梳理,尤其是在全基因組的層面上對我省霍亂弧菌的基因多態(tài)性和遺傳發(fā)生關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)的分析。隨著新一代測序技術(shù)的成熟,WGS分型所需時間不斷縮短,成本不斷降低,全基因組測序分型不僅能夠全面反映基因組進(jìn)化特點(diǎn),對于研究病原菌的遺傳與變異以及對傳染源的溯源分析均具有重要價值和明顯優(yōu)勢。本研究選取廣東省1961-2013年50多年間從霍亂病例分離的381株01群(稻葉型148株,小川型233株)和136株0139群霍亂弧菌代表性菌株進(jìn)行血清分型、毒力基因PCR檢測、ctxB和tcpA基因擴(kuò)增產(chǎn)物測序分型和PFGE分子分型,以全面了解和掌握我省霍亂弧菌基本的菌型分布和分子特征,然后根據(jù)PFGE指紋圖譜、ctxB和tcpA基因分型結(jié)果,選擇154株代表性的菌株進(jìn)行全基因組測序分型。將這154株代表菌株的全基因組序列與另外126株國內(nèi)其它省份代表株和107株國際代表株的全基因組序列進(jìn)行基于全基因組的單核苷酸多態(tài)性鑒定(wg-SNPs)和構(gòu)建最大似然樹,以此深入分析我省霍亂弧菌基因變異情況,并結(jié)合流行病學(xué)資料,構(gòu)建我省霍亂弧菌種系發(fā)生關(guān)系,推斷病原體的進(jìn)化過程,從分子遺傳的角度闡明我省不同時期霍亂的流行特點(diǎn),從分子機(jī)制上深入理解我省霍亂弧菌菌株變遷進(jìn)化和變異規(guī)律,為今后霍亂弧菌分子流行病學(xué)監(jiān)測、暴發(fā)識別和精確溯源分析提供研究基礎(chǔ)。研究目的：1.系統(tǒng)地了解和掌握1961年廣東省首次暴發(fā)O1群埃爾托型霍亂,至2013年期間,我省O1群和O139群霍亂弧菌病例分離株的血清型別轉(zhuǎn)換分布規(guī)律、主要毒力基因攜帶和PFGE分子分型特征；2.在全基因組的水平上,分析我省O1群和O139群霍亂弧菌遺傳進(jìn)化和變異特征,構(gòu)建我省霍亂弧菌種系發(fā)生關(guān)系,摸清我省不同流行階段霍亂弧菌的傳染來源和流行路線等分子流行特征。為構(gòu)建廣東省霍亂弧菌分子溯源數(shù)據(jù)庫,建立基于wg-SNPs的高分辨力的霍亂弧菌分子流行病學(xué)監(jiān)測、暴發(fā)識別和溯源分析體系提供依據(jù)。研究內(nèi)容與方法：1.文獻(xiàn)調(diào)查研究：通過文獻(xiàn)調(diào)研的方式查閱1961年以來廣東省霍亂流行史料,并根據(jù)霍亂監(jiān)測資料和流行特征,將1961年以來廣東省霍亂流行分為4個時期,根據(jù)不同流行時期,不同地區(qū),癥狀的輕重以及不同的血清亞型選取代表性病例菌株517株,其中O1群霍亂弧菌381株(小川型233株,稻葉型148株),O139群霍亂弧菌136株。2.菌株復(fù)蘇和復(fù)核鑒定：用普通營養(yǎng)肉湯對凍干菌株進(jìn)行復(fù)蘇,并用普通API生化鑒定和血清分型對菌株進(jìn)行再鑒定、以核實菌株的型別。3.菌株毒力基因檢測：采用QIAgen DNA minikit試劑盒進(jìn)行菌株核酸提取,并采用普通PCR的方法對菌株的ctxB, ace, zot, tcpA, tcpl, hlyA, ompU, rtxC和st等常見霍亂毒力基因進(jìn)行PCR定性檢測,對ctxB和tcpA基因陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序分型。4. PFGE分子分型：對代表性菌株進(jìn)行NotI限制性內(nèi)切酶消化后進(jìn)行PFGE分子分型。利用BioNumericsV6.6軟件(Applied Maths BVBA)分析PFGE指紋圖譜,得到菌株帶型相似性的聚類分析樹圖(UPGMA)。5.全基因組測序分型分析：根據(jù)上述實驗結(jié)果,選取代表性菌株154株進(jìn)行全基因組測序分型,以標(biāo)準(zhǔn)參考菌株N16961的全基因組序列為參照序列進(jìn)行de novo方式拼接和組裝,使用MuMMER進(jìn)行全基因組的SNPs (wg-SNPs)鑒定和分析,分析我省霍亂弧菌基因變異情況,并結(jié)合流行病學(xué)資料,根據(jù)非重組位點(diǎn)以MEGA6.0構(gòu)建最大似然樹,分析我省霍亂弧菌種系發(fā)生關(guān)系。研究結(jié)果：1.流行分布特征：1961年首次暴發(fā)01群埃爾托型霍亂,至2013年期間,廣東霍亂流行可分成4個流行期,每一個流行期都與一個優(yōu)勢菌型相關(guān),且具有相對獨(dú)特的流行病學(xué)特征。其中,第一次流行期(1961-1969年)的優(yōu)勢菌型是01群小川型；第二次流行期(1978-1989年)優(yōu)勢菌型為01群稻葉型；第三次流行期(1990-1999年)優(yōu)勢菌型為01群小川型；第四次流行性(2000-2013年)以小型暴發(fā)和散發(fā)為主,優(yōu)勢菌型為01群稻葉型。而1993年出現(xiàn)的0139群霍亂弧菌,至今近20年間,主要以散發(fā)和小型暴發(fā)為主,從未引起大規(guī)模的暴發(fā)流行。2.毒力基因攜帶情況：1)381株01群埃爾托霍亂弧菌中,有367株同時攜帶了ctxB, ace和zot基因,374株攜帶了tcpA基因,其余14株為ctxB, ace和zot基因陰性。PCR產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn),1992年以及之前分離到的160株為埃爾托型ctxB,1993年及以后分離的207株中,除1株為埃爾托型ctxB外,其余的均為古典型ctxB,而所有tcpA基因均為埃爾托基因型。2)136株0139群霍亂弧菌中,有123株同時攜帶了ctxB, ace和zot基因,123株攜帶了tcpA基因,其余10株為ctxB, ace和zot基因陰性。PCR產(chǎn)物測序分析發(fā)現(xiàn),113株為ctxB基因3型(埃爾托型),7株為ctxB基因1型(古典型),3株為ctxB基因5型,而所有tcpA基因均為埃爾托型。3. PFGE分子分型：1)381株01群埃爾托霍亂弧菌經(jīng)過Not I限制性內(nèi)切酶消化后,可分成113個不同的PFGE指紋圖譜,并進(jìn)一步分析形成5個cluster,不同流行時期的菌株分別對應(yīng)形成不同的cluster,如cluster I (第一次流行期),Ⅱ(第三次流行期),Ⅲ(第二次流行期)和Ⅳ(第四次流行期)。cluster V中包含了四個不同流行時期的菌株,菌株之間指紋圖譜的相似度較低,顯示出明顯的異質(zhì)性,可進(jìn)一步劃分出10個以上不同的譜系。優(yōu)勢菌型為小川型的cluster I和Ⅱ之間的相似度為80.3%,優(yōu)勢菌型為稻葉型的cluster III和Ⅳ之間的相似度為81.6%。2)136株0139群霍亂弧菌經(jīng)過Not I限制性內(nèi)切酶消化后,可分成75個不同的PFGE指紋圖譜,進(jìn)一步分析可形成2個cluster:cluster A和cluster Bo其中,cluster A主要包含了7株1998-2000年間分離的非產(chǎn)腸毒素0139群霍亂弧菌,這7株非產(chǎn)腸毒素菌株的PFGE指紋圖譜均不相同。cluster B中主要包含了所有的產(chǎn)腸毒素0139群霍亂弧菌以及其它的非產(chǎn)腸毒素菌株(分離自1998和2007年),cluster B中68個PFGE指紋圖譜的相似度為82.4%。4.全基因組測序分析：1)387個全基因組經(jīng)過MuMMER鑒定和分析,我們共鑒定出來10396個SNPsc其中,3351個SNPs位點(diǎn)是特定于外群菌株M66(1961年第七次霍亂大流行之前分離的菌株),其余的5534個SNPs可用于區(qū)別來自1961年以來的第七次大流行的387個基因組。2)我省分離的O1群埃爾托霍亂弧菌菌株中重組現(xiàn)象非常少見,只有1511個SNPs由重組導(dǎo)致,主要發(fā)生在O抗原合成基因簇以及霍亂第七次大流行基因島II (Vibrio Seventh Pandemic Island)中,其它SNPs均由突變事件導(dǎo)致。3)我省在第一次流行期初期分離的O1群埃爾托霍亂弧菌與霍亂第七次世界大流行初期印度尼西亞的菌株遺傳距離很近,比國內(nèi)其它省份在同期分離的菌株更接近最大似然樹的根部。在第二次流行階段早期分離的01群埃爾托霍亂弧菌,有部分代表株獨(dú)自成簇,比國內(nèi)其它省份同期分離的菌株更靠近進(jìn)化發(fā)生樹的根部。4)在遺傳進(jìn)化樹上,廣東省分離的O1群霍亂弧菌在至少在兩個分支中處于根部,是同期南亞分離株的最近共同始祖(Most Recently Common Ancestor, MRCA),緊隨這些南亞菌株之后,又是從中國多個省份(包括廣東省)分離到的O1群霍亂弧菌。5)在O139群霍亂弧菌的遺傳分支中,1993年廣東省分離的最早兩株0139群霍亂弧菌處于該遺傳分支的最靠近根部的進(jìn)化分支,并且其與O1群埃爾托型霍亂弧菌菌株的遺傳距離最近。1998年之前分離的O139群霍亂弧菌中,廣東省分離的霍亂弧菌在遺傳分支上均處于相對根部的位置。而1998年之后分離的霍亂弧菌中,廣東省分離的霍亂弧菌很少處于相對根部的位置。研究結(jié)論：1.1961-2013年,廣東省霍亂流行具有階段性的特征,根據(jù)每一階段的流行病學(xué)特征和病原學(xué)特征,可大致分成四個流行期,每一個流行期都與一個優(yōu)勢菌型相關(guān)：第一次流行期為小川型(1961-1964年),第二次流行期為稻葉型(1978-1989年),第三次流行期又是小川型(1990-1999年),第四次流行期主要是稻葉型(2000-2013年),這種優(yōu)勢菌型的變換與我國其他地方以及周邊亞洲國家的變化態(tài)勢類似。2.1992年之前的分離O1群霍亂弧菌均攜帶埃爾托型ctxB等位基因ctxBEITor,而1992年之后的分離的O1群霍亂弧菌均攜帶古典型ctxB等位基因ctxB這個等位基因的變化與我國其他的地方,以及亞洲、非洲和拉丁美洲霍亂弧菌的變化一致。3.O139群分離株基本上都是ctxB基因3型,即埃爾托型。在本研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)在O139群霍亂弧菌發(fā)現(xiàn)ctxB基因1型(古典型)和基因5型,這表明,ctxB基因的變異不僅僅發(fā)生在O1群霍亂弧菌上,O139群霍亂弧菌同樣可能出現(xiàn)這種非埃爾托型的變異。4.381株O1群霍亂弧菌PFGE指紋圖譜可聚類成5個cluster,高度相關(guān)的菌株均來自同一個流行期,提示每一次大流行期的開始,均是由一個新的變異株的引入。5.PFGE指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn),O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株維持著相對緊密的克隆群,從不同地區(qū)分離到的菌株之間的遺傳關(guān)系相近,而非產(chǎn)霍亂腸毒素的O139群霍亂弧菌則表現(xiàn)出豐富的多樣性和多克隆譜系。6.全基因組單核苷酸多態(tài)性分析顯示,我省病例分離的O1/O139群霍亂弧菌產(chǎn)毒株在遺傳學(xué)上顯示出高度單態(tài)性,菌株之間的差異絕大多數(shù)是由突變所導(dǎo)致。7.在01群霍亂弧菌的某些進(jìn)化分支上,我省分離的菌株出現(xiàn)單獨(dú)聚集成簇的現(xiàn)象,體現(xiàn)出一定的地域聚集性,該現(xiàn)象可能因這些菌株的傳播能力較弱,沒有引起廣泛的傳播和流行。8.霍亂傳播模式的改變與菌株的遺傳進(jìn)化特征密切相關(guān),在O139流行的初期,其傳播特點(diǎn)類似于O1群埃爾托型菌株。1998年之后,O139的流行特點(diǎn)更類似于食源性傳播的模式。9.我省O1/O139群霍亂分離株在國內(nèi)和國際代表株中的特殊遺傳進(jìn)化特征,與我省所處特殊的地理位置,與南亞頻繁的貿(mào)易交流中輸入性病例有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R378

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