本文選題：銅綠假單胞菌 + 彈性蛋白酶�。� 參考：《中國人獸共患病學報》2013年02期

【摘要】：目的敲除銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因,獲得無彈性蛋白酶活性的銅綠假單胞菌菌株。方法采用PCR從pKD46質(zhì)粒上擴增λ噬菌體的Red重組酶基因,并將其克隆到大腸桿菌和銅綠假單胞菌穿梭質(zhì)粒pUCP多克隆位點上,電擊轉(zhuǎn)化銅綠假單胞菌PAO1感受態(tài)細胞,構(gòu)建PAO1/pUCP-Red基因敲除體系。常規(guī)基因操作構(gòu)建兩端與彈性蛋白酶基因上、下游同源,中間為慶大霉素抗性基因的線性打靶片段;并將其電擊轉(zhuǎn)化pUCP-Red/PAO1感受態(tài);采用慶大霉素和羧芐青霉素抗性平板初步篩選陽性重組菌;通過PCR、RT-PCR及彈性蛋白酶活性檢測方法,鑒定菌株彈性蛋白酶基因的敲除情況。結(jié)果本研究通過構(gòu)建Red重組系統(tǒng),獲得了無彈性蛋白酶活性的銅綠假單胞菌菌株。結(jié)論本研究成功敲除了銅綠假單胞菌彈性蛋白酶基因,所獲無彈性蛋白酶活性的菌株將為系統(tǒng)深入研究彈性蛋白酶在銅綠假單胞菌致病性中的詳細作用機理提供材料和基礎。
[Abstract]:Objective to knockout the elastase gene of Pseudomonas aeruginosa and obtain a strain of Pseudomonas aeruginosa with no elastase activity. Methods the Red recombinant enzyme gene of 位 phage was amplified by PCR from pKD46 plasmid and cloned into E. coli and Pseudomonas aeruginosa shuttle plasmid pUCP polyclonal site. The PAO1 / pUCP-Red gene knockout system was constructed. Conventional gene manipulation was performed to construct a linear target fragment of gentamicin resistance gene, which was homologous to elastase gene upstream and downstream, and was transformed into pUCP-Red- / PAO1 receptive state by electroporation. Gentamicin and Carbenicillin resistant plates were used to screen the positive recombinant bacteria, and the knockout of elastase gene was identified by PCR and elastase assay. Results A strain of Pseudomonas aeruginosa with no elastase activity was obtained by constructing Red recombination system. Conclusion this study successfully knockout the elastase gene of Pseudomonas aeruginosa. The obtained strains with no elastase activity will provide materials and basis for further study on the detailed mechanism of elastase in the pathogenicity of Pseudomonas aeruginosa.
【作者單位】： 第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院醫(yī)學實驗技術(shù)中心;
【基金】：國家自然科學基金(No.30970115)資助~~
【分類號】：R378

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本文編號：2080262