本文選題：LW-AFC + 阿爾茨海默病��； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer`s disease,AD)屬神經(jīng)退行性疾病,是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。AD患者腦內(nèi)典型的病理變化主要包括腦細(xì)胞外的β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)斑塊即老年斑(senile plague)、細(xì)胞內(nèi)沉積的磷酸化tau蛋白引起的神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失。AD的臨床癥狀主要為進(jìn)行性的記憶損害以及其他認(rèn)知功能的下降,AD患者確診后的平均存活時間為9年,期間必須有專人進(jìn)行看護(hù),因此AD對于社會、家庭都是巨大的負(fù)擔(dān)。目前用于AD治療的藥物主要分為乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天冬氨酸(N-Methyl-DAspartate,NMDA)受體拮抗劑兩大類,分別靶向膽堿能和谷氨酸能突觸傳遞。其中乙酰膽堿酯酶抑制劑主要針對治療輕中度AD,而NMDA受體拮抗劑主要治療中重度AD。但是臨床數(shù)據(jù)顯示,這些藥物對于AD的治療效果并不理想,僅能夠改善部分癥狀。此外,抗精神病藥、抗抑郁藥、抗驚厥藥、免疫療法、β-分泌酶/γ-分泌酶抑制劑、α-分泌酶激動劑、tau蛋白聚集/磷酸化抑制劑、金屬離子螯合劑和維生素也用于改善AD患者的認(rèn)知功能和生活質(zhì)量,但治療效果依舊不理想。因此,目前為止,仍然沒有能夠有效預(yù)防或治療AD的方法。上世紀(jì)90年代,我室與天然藥物化學(xué)研究室及沈陽藥科大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室密切合作,對中醫(yī)滋補(bǔ)腎陰的經(jīng)典代表名方六味地黃湯的藥理作用、作用機(jī)理及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了系統(tǒng)研究。研究表明,六味地黃湯對快速老化模型小鼠SAMP8等多種模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力低下具有明顯改善作用。LW-AFC是從六味地黃湯中分離獲得的由活性成分群構(gòu)成的中藥新藥,主要含苷類(LWD-b)、多糖(LWB-B)和寡糖(CA-30)三個主要藥效組分,具有藥效穩(wěn)定、質(zhì)量可控、制劑先進(jìn)、服用方便等優(yōu)點(diǎn)。該藥已獲臨床批件,申報的第一個適應(yīng)癥為更年期綜合征,目前正在進(jìn)行II期臨床試驗。本研究以快速老化小鼠SAMP8和家族型AD(familial Alzheimer`s disease,FAD)模型小鼠Pr P-h AβPPswe/PS1ΔE9(APP/PS1)轉(zhuǎn)基因小鼠作為模型,研究了LW-AFC對中樞學(xué)習(xí)記憶能力、病理改變以及生物標(biāo)志物的作用。以高月齡自然衰老小鼠SAMR1為衰老模型,觀察LW-AFC的抗衰老作用。通過檢測HPA軸和HPG軸中的激素水平、脾淋巴細(xì)胞的增殖能力、脾淋巴細(xì)胞的亞群分型以及血漿中細(xì)胞因子的水平,揭示LW-AFC防治AD的作用機(jī)制及靶點(diǎn)。第一部分LW-AFC改善中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用研究1.LW-AFC對SAMP8小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用研究選取6月齡雄性SAMP8小鼠,分別灌胃給予多奈哌齊(donepezil)(1mg/kg)、美金剛(memantine)(10mg/kg)、LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg),以SAMR1小鼠作為對照。3個月后進(jìn)行老化程度評分和自主活動實驗,觀察LW-AFC對SAMP8小鼠衰老程度的影響;運(yùn)用跳臺實驗、穿梭箱實驗、Morris水迷宮實驗以及新異物體識別實驗,觀察LW-AFC對SAMP8小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用。結(jié)果顯示,給予1.6g/kg的LW-AFC能夠明顯降低SAMP8小鼠的老化評分;美金剛和LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg、3.2g/kg)能夠顯著提高SAMP8小鼠的自主活動度;1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SAMP8小鼠的被動回避反應(yīng)能力;美金剛、0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SAMP8小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和主動回避反應(yīng)能力;1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著提高SAMP8小鼠的短、長期物體識別記憶能力。該結(jié)果表明,LW-AFC能夠有效降低SAMP8小鼠的衰老程度,改善其學(xué)習(xí)記憶能力,且效果要優(yōu)于陽性藥多奈哌齊和美金剛。2.LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用研究選取APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠作為FAD的模型小鼠,分別灌胃給予多奈哌齊(1mg/kg)、美金剛(10mg/kg)、LW-AFC(1.6g/kg),C57小鼠作為對照。3個月后進(jìn)行跳臺實驗、穿梭箱實驗、Morris水迷宮實驗以及新異物體識別實驗,觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用;采用免疫熒光染色和尼氏染色,觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ的沉積與神經(jīng)元丟失的作用;采用Alpha ELSA技術(shù)檢測血液和腦組織中的可溶性Aβ含量,觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠中Aβ水平的影響。結(jié)果顯示,APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于野生型小鼠,給予LW-AFC、美金剛和多奈哌齊能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的主動回避反應(yīng)能力;LW-AFC和美金剛能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶能力;LW-AFC能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的短期物體識別記憶能力和被動回避反應(yīng)能力;與野生型小鼠相比,APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中Aβ斑塊、海馬和血漿中Αβ1-40和Αβ1-42的水平明顯升高,海馬、CA1區(qū)和CA3區(qū)中的尼氏小體數(shù)量明顯降低,給予LW-AFC、美金剛均能夠顯著減少APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦中的Aβ沉積,降低海馬中的Αβ1-42水平,同時LW-AFC還能降低外周血中的Αβ1-42含量。LW-AFC能夠明顯增加海馬中,特別是CA3區(qū)中的尼氏小體數(shù)量。該結(jié)果表明,LW-AFC能夠顯著改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,并明顯減少腦中Aβ斑塊和神經(jīng)元丟失,同時降低腦和血液中的可溶性Aβ水平。3.LW-AFC對自然衰老SAMR1小鼠延緩衰老的作用研究使用12月齡和24月齡的SAMR1小鼠作為衰老小鼠模型,分別灌胃給予褪黑素(melatonin)(1mg/kg)和LW-AFC(1.6g/kg),7月齡的SAMR1小鼠和ICR小鼠作為對照。3個月后進(jìn)行老化評分、生存期、體重變化、自主活動、空間學(xué)習(xí)記憶等指標(biāo)檢測。結(jié)果顯示,12和24月齡SAMR1小鼠的老化評分要明顯高于對照組7月齡的SAMR1小鼠和ICR小鼠,給予LW-AFC能夠分別在給藥30天和45天后,顯著降低12和24月齡SAMR1小鼠的老化評分;LW-AFC能夠明顯提高12月齡SAMR1小鼠的生存率和平均生存天數(shù),以及12和24月齡SAMR1小鼠的平均體重;LW-AFC能夠顯著改善12和24月齡的SAMR1小鼠的空間記憶能力。表明LW-AFC能夠延緩自然衰老SAMR1小鼠的衰老進(jìn)程。第二部分LW-AFC改善中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)理研究1.LW-AFC對SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用為觀察LW-AFC對SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用,采用3H-Td R摻入法檢測SAMP8小鼠脾細(xì)胞的增殖能力,流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞亞型,液相蛋白芯片技術(shù)檢測血漿中細(xì)胞因子的含量,放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測HPA軸和HPG軸中激素水平的變化。結(jié)果表明,SAMP8小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的功能明顯紊亂,給予1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著降低SAMP8小鼠下丘腦中CRH水平;0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著降低SAMP8小鼠下丘腦中Gn RH水平、垂體中ACTH、LH和FSH水平;0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著提高血漿中T水平,而美金剛僅能降低LH的水平。對于SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖,美金剛和多奈哌齊能夠明顯提高Con A和LPS刺激的SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖能力,此外多奈哌齊還能顯著提高其脾淋巴細(xì)胞的自發(fā)增殖能力,而0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠明顯提高自發(fā)和Con A刺激的增殖能力,0.8g/kg和3.2g/kg的LW-AFC能夠顯著提高LPS刺激的脾淋巴細(xì)胞增殖能力。對于SAMP8小鼠的脾淋巴細(xì)胞亞型,給予美金剛和LW-AFC(0.8g/kg和1.6g/kg)能夠顯著提高CD3+CD4+T細(xì)胞的表達(dá)量,多奈哌齊和LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg)能夠顯著提高CD8+CD28+T細(xì)胞的表達(dá)量,美金剛、多奈哌齊和LW-AFC(0.8g/kg、1.6g/kg和3.2g/kg)能夠顯著提高CD19+B細(xì)胞的表達(dá)量;美金剛、多奈哌齊和LW-AFC(0.8g/kg和1.6g/kg)能夠顯著提高CD19+CD80+B細(xì)胞的表達(dá)量,美金剛和多奈哌齊明顯降低了CD3+CD8+T細(xì)胞的表達(dá)量。多奈哌齊顯著提高了SAMP8小鼠血液中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)量,而LW-AFC(1.6g/kg)則能夠明顯降低其表達(dá)量。此外,美金剛、多奈哌齊和LW-AFC(0.8g/kg和1.6g/kg)能恢復(fù)CD4+/CD8+的平衡。對于SAMP8小鼠血液中的細(xì)胞因子水平,給予SAMP8小鼠美金剛,能夠顯著降低其血液中IL-23、TNF-β和eotaxin的水平,多奈哌齊僅能夠降低IL-23的水平,LW-AFC(0.8、1.6和3.2 g/kg)則能夠明顯降低IL-1β、IL-23、GM-CSF、IFN-γ、eotaxin、TNF-α、TNF-β的水平,升高M(jìn)CP-1的分泌水平,而0.8g/kg和1.6g/kg的LW-AFC能夠顯著降低IL-2、IL-6和RANTES的水平,1.6g/kg的LW-AFC還能夠明顯提高IL-5的水平。這些結(jié)果提示,LW-AFC能夠有效恢復(fù)或改善SAMP8小鼠HPA軸和HPG軸平衡,并通過增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖能力、恢復(fù)失衡的淋巴細(xì)胞亞型、調(diào)控異常分泌的細(xì)胞因子等途徑,調(diào)節(jié)或改善免疫功能,進(jìn)而對SAMP8小鼠處于平衡失調(diào)、功能紊亂狀態(tài)的NIM網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,改善或恢復(fù)其平衡狀態(tài)。2.LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用為觀察LW-AFC對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用,采用放射免疫法、化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)免疫吸附法檢測APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠HPA軸和HPG軸的變化;液相蛋白芯片技術(shù)檢測血漿中細(xì)胞因子的含量。結(jié)果表明,APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的NIM網(wǎng)絡(luò)平衡紊亂,給予美金剛和LW-AFC能夠顯著降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的垂體中的ACTH水平;LW-AFC能夠明顯降低下丘腦中的Gn RH、垂體中的FSH和LH的水平,美金剛則能夠顯著降低FSH和LH的水平。美金剛、多奈哌齊和LW-AFC都能夠顯著提高APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠脾細(xì)胞上清液中CD8+CD28+T細(xì)胞的表達(dá)量,美金剛和LW-AFC則能夠明顯降低CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)量。美金剛能夠顯著降低APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠血液中IL-1β、IL-6、IL-23、GM-CSF和TNF-β的水平,多奈哌齊僅能降低IL-1β的水平,LW-AFC則能夠顯著降低IL-1β、IL-2、IL-6、IL-23、GM-CSF、TNF-α、TNF-β和eotaxin的分泌水平,同時還能夠明顯提高IL-4和G-CSF的水平。該結(jié)果表明,LW-AFC能夠調(diào)節(jié)或改善APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的功能紊亂。3.LW-AFC對自然衰老SAMR1小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)作用為觀察LW-AFC對衰老動物模型NIM網(wǎng)絡(luò)中“免疫衰老”的作用,采用3H-Td R摻入法檢測高月齡SAMR1小鼠脾細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞術(shù)檢測脾淋巴細(xì)胞亞型;液相蛋白芯片技術(shù)檢測血漿中細(xì)胞因子的含量。結(jié)果表明,12和24月齡的SAMR1小鼠都具有一定程度的免疫功能低下和慢性炎癥。給予褪黑素和LW-AFC能夠顯著提高12月齡SAMR1小鼠脾細(xì)胞的自發(fā)增殖能力,同時褪黑素和LWAFC還能夠提高12和24月齡SAMR1小鼠Con A和LPS刺激的脾細(xì)胞增殖能力。對于脾淋巴細(xì)胞亞型,褪黑素能夠明顯恢復(fù)12和24月齡的SAMR1小鼠CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的表達(dá)量以及12月齡SAMR1小鼠的CD4+/CD8+的比值和24月齡SAMR1小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)量;LW-AFC能顯著恢復(fù)12和24月齡的SAMR1小鼠CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD19+B細(xì)胞的表達(dá)量,同時還能改善24月齡的SAMR1小鼠CD3+T細(xì)胞、CD4+/CD8+和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的表達(dá)紊亂。褪黑素能夠明顯改善12月齡SAMR1小鼠外周血中9個促炎因子(eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α)以及全部抗炎因子(G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10)的水平異常,也能改善24月齡SAMR1小鼠外周血中8個促炎因子(GMCSF、IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α、TNF-β)和1個抗炎因子(IL-4)的水平異常;給予LW-AFC能夠顯著改善12月齡SAMR1小鼠外周血中11個促炎因子(eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β)以及全部抗炎因子(G-CSF、IL-4、IL-5、IL-10)的水平異常,也能夠改善24月齡SAMR1小鼠外周血中12個促炎因子(eotaxin、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-17、MCP-1、RANTES、TNF-α、IL-23、TNF-β)的水平異常,但對抗炎因子無效。該結(jié)果提示,LW-AFC能夠通過調(diào)節(jié)高月齡SAMR1小鼠的免疫功能低下,降低慢性炎癥,延緩SAMR1小鼠的免疫衰老。4.LW-AFC對NIM網(wǎng)絡(luò)的作用靶點(diǎn)分析為深入研究LW-AFC改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能的作用靶點(diǎn)。采用Pearson相關(guān)性分析的方法,對SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠NIM網(wǎng)絡(luò)中激素、細(xì)胞因子與其認(rèn)知功能相關(guān)性進(jìn)行了研究與分析,發(fā)現(xiàn)NIM網(wǎng)絡(luò)與認(rèn)知功能具有相關(guān)性;采用多重線性回歸分析,發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)內(nèi)分泌方面,HPG軸中的LH、T和Gn RH與SAMP8小鼠的認(rèn)知功能相關(guān);HPG軸的T和LH,HPA軸中的ACTH與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能相關(guān)。在細(xì)胞因子方面,Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α),IL-23,趨化因子(eotaxin、RANTES)與SAMP8小鼠的認(rèn)知功能相關(guān);Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-6),趨化因子(eotaxin)與APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的認(rèn)知功能相關(guān)。對于SAMP8小鼠,LW-AFC可調(diào)節(jié)與認(rèn)知功能緊密相關(guān)的分子為:Gn RH、LH、T、GM-CSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin、RANTES。對于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠,LWAFC可調(diào)節(jié)與認(rèn)知功能緊密相關(guān)的分子為:ACTH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示這些分子有可能是LW-AFC防治AD的潛在作用靶標(biāo),對不同的AD動物模型,LW-AFC能夠通過作用于不同的靶點(diǎn),改善不同原因所導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷。通過以上研究,本研究主要得出以下結(jié)論:1.LW-AFC能夠改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的主動、被動回避反應(yīng)能力、空間學(xué)習(xí)記憶能力和物體識別記憶能力;此外,能降低自然衰老SAMR1小鼠的老化度評分、延長生存期,表明長期口服給予LW-AFC對AD模型動物學(xué)習(xí)記憶功能具有明顯改善作用,并具有明顯抗衰老作用。2.LW-AFC能夠明顯改善SAMP8小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠所表現(xiàn)的HPA軸和HPG軸平衡失調(diào),糾正或改善淋巴細(xì)胞亞型分布及細(xì)胞因子分泌異常;此外,改善和調(diào)節(jié)自然衰老SAMR1小鼠免疫功能,表明長期口服給予LW-AFC對AD模型動物神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫功能紊亂均具有明顯調(diào)節(jié)作用。3.LW-AFC能夠改善多種模型動物學(xué)習(xí)記憶功能、改善神經(jīng)內(nèi)分泌及免疫功能。對于SAMP8小鼠,LW-AFC主要通過作用于Gn RH、LH、T、GMCSF、IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-23、eotaxin和RANTES改善認(rèn)知;對于APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠,LW-AFC則主要作用于ACTH、LH、GM-CSF、IL-6、eotaxin。提示LW-AFC對改善AD模型小鼠中樞學(xué)習(xí)記憶功能的作用是通過調(diào)節(jié)NIM網(wǎng)絡(luò)平衡而發(fā)揮的。4.LW-AFC與已有防治AD藥物不同,調(diào)節(jié)、恢復(fù)和維護(hù)NIM網(wǎng)絡(luò)的平衡是LW-AFC的作用特點(diǎn),也是其基本作用機(jī)理,特色明顯,具有防治AD潛在的臨床價值和良好的開發(fā)前景。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16;R-332
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本文編號：2049024