本文選題：狂犬病毒 + 糖蛋白�。� 參考：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患的全球性傳染疾病,存在于全球150多個(gè)國(guó)家和地區(qū),根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO 2016的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),全球每年大約有59000人死于該病,其中95%發(fā)生在亞洲和非洲等發(fā)展中國(guó)家。狂犬病是一種在出現(xiàn)臨床癥狀后幾乎100%會(huì)致命的病毒性傳染病,因此研制狂犬疫苗對(duì)于預(yù)防與控制狂犬病毒傳播是非常必要的。糖蛋白(G)是狂犬病病毒唯一能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的蛋白,也能有效的刺激T淋巴細(xì)胞增殖,并決定病毒的毒力。近些年的實(shí)驗(yàn)研究顯示,天然的狂犬病毒糖蛋白(G)是以三聚體形式存在的跨膜糖蛋白,然而可溶性G蛋白單體的免疫原性和保護(hù)性效果并不十分理性,表明狂犬病毒G蛋白的有效免疫原性是非常依賴(lài)G蛋白三聚體空間構(gòu)象的完整性。Fibritin foldon(Fd)是T4噬菌體fibritin蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域,能夠輔助fibritin蛋白質(zhì)形成三聚體,并通過(guò)氫鍵、疏水相互作用和鹽橋的方式來(lái)穩(wěn)定天然三聚體結(jié)構(gòu)。利用foldon的這種性質(zhì),融合可溶性蛋白質(zhì)形成三聚體,幫助并穩(wěn)定目的蛋白形成正確的、免疫原性更高的構(gòu)象,從而達(dá)到更好的治療與預(yù)防效果。目前已被廣泛應(yīng)用于流感病毒糖蛋白,HIV-1,RSV糖蛋白等,并獲得理想的效果。自1994年以來(lái),DNA疫苗已被提議作為用于預(yù)防傳染性疾病便宜、有效的策略,且其可行性已經(jīng)在許多動(dòng)物模型中被驗(yàn)證,并被用于人類(lèi)病毒疫苗臨床試驗(yàn)中。經(jīng)過(guò)二十多年的研究,證實(shí)了 DNA疫苗對(duì)多種感染性(病毒,細(xì)菌和寄生蟲(chóng))和非感染性(過(guò)敏和腫瘤)疾病能引起有效的細(xì)胞免疫和體液免疫。同時(shí)DNA疫苗具有成本低,設(shè)計(jì)和管理簡(jiǎn)單,生產(chǎn)相對(duì)較快的優(yōu)勢(shì),為DNA狂犬疫苗領(lǐng)域的發(fā)展注入新的動(dòng)力。本文以真核VR1012質(zhì)粒為載體,分別構(gòu)建了 G蛋白全長(zhǎng)(mRVG)質(zhì)粒,G蛋白截?cái)嘈?包含有分泌信號(hào)肽和胞外區(qū),mRVGst)質(zhì)粒,具有foldon結(jié)構(gòu)域的G蛋白融合(tRVGst-LI、tRVGst-IQG8)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒能表達(dá)不同大小的G蛋白,以CpG為免疫佐劑,對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。經(jīng)過(guò)3次免疫后,結(jié)果顯示,小鼠產(chǎn)生了較強(qiáng)的IgG水平,mRVG(全長(zhǎng)型抗原)免疫組抗體IgG是mRVGst(截短型抗原)免疫組抗體水平的1.6倍,是tRVGst-LI、tRVGst-IQG8(融合型抗原)免疫組的1.4倍;tRVGst-LI與tRVGst-IQG8免疫組分泌的IgG抗體是mRVGst(截短型抗原)免疫組的1.4倍。經(jīng)過(guò)抗體分型以及細(xì)胞因子檢測(cè)后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)DNA疫苗產(chǎn)生了較強(qiáng)的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答。通過(guò)快速熒光灶抑制試驗(yàn)(RFFIT)檢測(cè)中和抗體(RVNA)活性,并通過(guò)顱內(nèi)攻毒實(shí)驗(yàn)研究該DNA疫苗的保護(hù)力。結(jié)果顯示,融合型抗原tRVGst-LI、tRVGst-IQG8中和抗體水平是9.3 IU/ml和12.7 IU/ml,保護(hù)力是50%～67%,免疫效果優(yōu)于截短型抗原mRVGst的4.3 IU/ml,16.7%,但是弱于全長(zhǎng)型抗原mRVG的17.4 IU/ml,保護(hù)力83.3%。表明foldon結(jié)構(gòu)域在一定程度上能增加可溶性融合G蛋白的免疫原性,但是G蛋白的免疫原性不僅與胞外區(qū)有關(guān),還與跨膜區(qū)及胞外區(qū)有關(guān),即更依賴(lài)于結(jié)構(gòu)的完整性。
[Abstract]:Rabies is a global infectious disease caused by rabies virus. It exists in more than 150 countries and regions around the world. According to the World Health Organization (WHO) WHO 2016 statistics, about 59000 people die of the disease every year in the world. Of these, 95 per cent occurred in developing countries such as Asia and Africa. Rabies is a viral infectious disease that can kill almost 100% of the patients after clinical symptoms. So it is necessary to develop rabies vaccine to prevent and control the spread of rabies virus. Glycoprotein G) is the only protein of rabies virus that can induce the host to produce neutralizing antibody. It can also effectively stimulate the proliferation of T lymphocytes and determine the virulence of the virus. Experimental studies in recent years have shown that natural rabies virus glycoprotein G) is a transmembrane glycoprotein in the form of trimer, but the immunogenicity and protective effect of soluble G protein monomer are not very rational. The results indicate that the effective immunogenicity of rabies virus G protein is highly dependent on the integrity of G protein trimer spatial conformation. Fibritin foldonnin Fd) is the domain of fibritin protein of T4 phage, which can assist fibritin protein to form trimer and through hydrogen bond. Hydrophobic interactions and salt bridges are used to stabilize the natural trimer structure. By using this property of foldon, the soluble protein is fused to form trimer, which helps and stabilizes the conformation of the target protein with higher immunogenicity and helps to achieve a better therapeutic and preventive effect. At present, it has been widely used in influenza virus glycoprotein, such as HIV-1 RSV glycoprotein, and obtained ideal results. Since 1994, DNA vaccine has been proposed as a cheap and effective strategy for the prevention of infectious diseases, and its feasibility has been verified in many animal models and used in clinical trials of human virus vaccine. After more than 20 years of research, it has been proved that DNA vaccine can induce effective cellular and humoral immunity against various infectious (viruses, bacteria and parasites) and non-infectious (allergy and tumor) diseases. At the same time, DNA vaccine has the advantages of low cost, simple design and management, and relatively fast production, which provides a new impetus for the development of DNA rabies vaccine field. In this paper, eukaryotic VR1012 plasmids were used to construct G protein full-length mRVGs, G protein truncated plasmids (including secretory signal peptide and extracellular region mRVGst1) plasmids, and G protein fusion plasmids with foldon domain. The recombinant plasmid could express G protein of different sizes and immunize BALB/c mice with CpG as immune adjuvant. After three times of immunization, the results showed that the antibody IgG of mRVG immunized mice was 1.6 times higher than that of mRVGST-immunized mice, and the results showed that the antibody level of mRVG immunized mice was 1.6-fold higher than that of mRVGST-immunized mice. The IgG antibody secreted by tRVGst-LI and tRVGst-IQG8 immunized group was 1.4 times higher than that of mRVGstimmunized group. After antibody typing and cytokine detection, the results showed that the DNA vaccine produced a strong Th1 cellular immune response. The activity of neutralization antibody was detected by rapid fluorescence foci inhibition test (RFFIT), and the protective effect of DNA vaccine was studied by intracranial attack test. The results showed that the neutralizing antibody levels of fusion antigen tRVGst-LItRVGst-IQG8 were 9.3 IU/ml and 12.7 IU/ml / ml, and the protective power was 50 ~ (67)%. The immune effect was better than that of truncated antigen mRVGst (4.3% / ml ~ 16.7g), but weaker than that of full-length antigen mRVG (17.4%), and the protective power was 83.3%. The results showed that foldon domain could increase the immunogenicity of soluble fusion G protein to some extent, but the immunogenicity of G protein was not only related to the extracellular domain, but also related to the transmembrane region and extracellular domain, which was more dependent on the integrity of the structure.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1971595