本文選題：低氧誘導因子-1α + p53RFP��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：一、研究背景缺血性疾病(冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦血管疾病、外周血管缺血性疾病)已經成為嚴重影響人類健康的重大疾病。因此,對于缺血性疾病,探索新的治療方法和途徑就顯得有一定的必要性。近年來,治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)為治療缺血性疾病的治療提供了一個新的方向。在治療性血管新生中,選擇作用于血管新生不同階段的幾種因子聯合應用或先后序貫性治療,或者選擇觸發(fā)血管新生的“主開關”的因子,可能取得更為明顯的療效。缺氧誘導因子HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)為上游細胞對低氧或缺氧,作出適應性反應的關鍵性轉錄因子,已證實能誘導多達100多種轉錄因子,立體地調整血管生成,為血運重建治療開辟新的思路。因此,HIF-1α是個十分有應用前景的治療因子,在醫(yī)學研究領域,得到了更多的重視。目前已經明確了HIF-1的結構和調控位點,它是由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成異二聚體。其中,HIF-1α是HIF-1能否發(fā)揮生物學活性的關鍵調節(jié)單位,其蛋白穩(wěn)定性和轉錄活性受氧濃度的高度調節(jié)；HIF-1β為組成性成分。在低氧條件下,HIF-1α表達水平增加,與HIF-1β形成異二聚體,從而具有生物學功能。HIF-1α穩(wěn)定性和活性受氧濃度的調節(jié),是由于HIF-1α含有氧依賴降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD)和轉錄激活區(qū)(Transactivation Domains)。常氧情況下,ODDD區(qū)Pro402和／或Pro564被脯氨酸羥化酶(prolylhydroxylase, PH)羥化后,被VHL腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumor suppressor)復合物識別,通過泛素蛋白酶途徑降解。同時,HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1α,FIH)與HIF-1α C末端轉錄激活區(qū)(C-TAD)結合,通過803位點天冬酰胺殘基(Asn803)的羥化,阻止C-TAD與輔助激活因子(CBP/p300)結合,從而抑制其轉錄活性。在前期的研究中,本課題組已將HIF-1α的564、402、803三個位點聯合定點突變,成功構建了三突變型HIF-1α-Triple表達載體(pcDNA-(3.1+)-HIF-1α-Triple),使其在常氧下能夠穩(wěn)定高效表達,為單因素研究HIF-1α基因的功能奠定了實驗基礎。p53RFP是新近發(fā)現的調控細胞增殖和凋亡的一個重要基因,受p53基因的調控,其產物具有E3泛素連接酶活性,通過泛素化降解凋亡重要啟動信號p21WAF1參與細胞增殖和凋亡,從而參與細胞周期的調控。目前對這個基因的研究較少。本課題組在前期研究中發(fā)現HIF-1α表達增加時,p53RFP基因表達上調。而作為具有E3泛素連接酶活性的p53RFP,是否能夠和HIF-1α特異性識別,啟動HEF-1α的泛素化降解途徑,以及可能存在的機制,并未有相關報道。二、研究目的本研究擬通過驗證p53RFP與HIF-1α的降解是否存在關系；進而探索其中可能存在的機制和通路,為進一步研究可能對此過程進行干預,使得HIF-1α在機體缺血低氧的環(huán)境中,發(fā)揮良性作用奠定理論基礎。三、研究方法1、SW480細胞置于低氧培養(yǎng)箱(1%O2,94% N2,5% CO2),在低氧培養(yǎng)的不同時間點,檢測HIF-1α和p53RFP蛋白表達水平,明確兩種蛋白在延遲低氧的條件下,是否都存在降解過程,推斷兩者可能存在的關系。2、加入蛋白酶抑制劑MG132,明確HIF-1α在延遲低氧環(huán)境下,是否通過泛素蛋白酶體途徑進行降解。3、通過干擾試驗,阻斷和促進細胞內p53RFP的表達,進一步證實HIF-1α在延遲低氧條件下的降解,是否和p53RFP相關。4、通過RT-PCR的方法,證實 p53RFP對HIF-1α轉錄水平是否存在影響。5、通過在常氧條件下,應用三突變型HIF-1α真核表達載體,證明p53RFP對HIF-1α的降解調節(jié)功能,是否依賴于VHL。6、通過在低氧條件下,應用p53抑制劑,探究p53RFP對HIF-1α的降解調節(jié)功能,是否依賴于p53。7、通過免疫共沉淀方法,驗證p53RFP是否通過泛素化方式和HIF-1α結合,進而發(fā)揮其促進HIF-1α降解的作用。8、通過在低氧條件下,應用組蛋白去乙�；敢种苿�,探究p53RFP對HIF-1α的降解調節(jié)功能,是否有組蛋白去乙�；窰DAC1和HDAC2的參與。9、通過在低氧條件下,應用HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA,進一步探究組蛋白去乙�；窰DAC1和HDAC2參與p53RFP對HIF-1α的降解,是否與HIF-1α的乙�；潭认嚓P。四、結果第一部分：HIF-1α的蛋白水平在低氧誘導后開始增加,在觀察的幾個時間點內,6小時左右HIF-1α在細胞內的達到最高峰,隨后的12,18,24小時內HIF-1α發(fā)生降解,并最終維持在較低的表達水平。在檢測內源性p53RFP蛋白表達時,發(fā)現隨著低氧培養(yǎng)時間的延長,p53RFP的表達也有一定幅度的增加。在加入蛋白酶抑制劑MG132后,HIF-1α的表達明顯上升,不同濃度的蛋白酶抑制劑MG132的阻斷HIF-1α降解效果,隨著濃度的增加,更加明顯。第二部分：與SW480細胞單獨低氧處理24小時組相比,瞬時轉染外源p53RFP質粒(1,2和6μg)的細胞其胞內HIF-1α蛋白的降解更為明顯,且p53RFP的表達量越高,促進HIF-1α蛋白的降解作用越明顯。瞬時轉染外源p53RFP SiRNA (976) 1,2,6ug的細胞其胞內HIF-1α蛋白的降解更不明顯,且p53RFP的表達量越低,減少HIF-1α蛋白的降解作用越明顯。常氧和延遲低氧條件下,轉染p53RFP與否,HIF-1α mRN A含量未發(fā)生明顯變化。第三部分：p53RFP和pcDNA-3.1 (+)-HIF-1α-triple轉染組與pcDNA-3.1(+)-HIF-1α-triple組相比,HIF-1α表達量明顯降低,降解增多,同時p53RFP的表達增加。p53RFP轉染組與是否加入p53抑制劑相比,p53RFP和HIF-1α的表達量無明顯改變,和未加任何干擾因素相比,p53RFP明顯升高,HIF-1α明顯降低。隨著低氧時間的延長,伴隨著其蛋白水平的降解,HIF-1α的乙�；头核鼗揎椝骄饾u增強。瞬時轉染不同濃度的p53RFP質粒1,2,6ug,經低氧培養(yǎng)24小時后,結果提示在低氧狀態(tài)下p53RFP可以與HIF-1α直接結合,并促進其泛素化修飾和降解。p53RFP轉染組與是否加入組蛋白去乙�；敢种苿┫啾�,HIF-1α的表達量明顯下降。p53RFP轉染組與是否加入HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA組相比, HIF-1α的乙�；潭仍黾�,與p53RFP結合增加,HIF-1α的降解也增加。五、結論第一部分：1.在延遲低氧的條件下,HIF-1α的表達,在初期(6小時左右)呈逐漸上升,隨后隨著缺氧時間的延長,HIF-1α發(fā)生了降解,并維持在低水平。在相同條件下,p53RFP的表達呈逐漸增加。2.延遲低氧條件下,HIF-1α的降解是通過泛素-蛋白酶體通路。第二部分：1.延遲低氧條件下,細胞轉染p53RFP質粒后,p53RFP表達增加,促進了HIF-1α降解,p53RFP的表達和HIF-1α的降解存在正相關性。2.延遲低氧條件下,沉默p53RFP表達后,p53RFP表達減少,減少了HIF-1α降解,進一步證實p53RFP的表達和HIF-1α的降解存在正相關性。3.常氧和延遲低氧條件下,p53RFP對HIF-1α的轉錄水平沒有影響。第三部分：1.p53RFP能夠促進三突變HIF-1α的降解。2.延遲低氧條件下,p53RFP參與的HIF-1α降解是VHL和p53非依賴的。3.延遲低氧條件下,p53RFP可以與HIF-la直接結合,并促進其泛素化修飾和降解。4.延遲低氧條件下,p53RFP參與的HIF-1α降解受到組蛋白去乙�；窰DAC1和HDAC2的負調控作用。
[Abstract]:Hypoxia - inducible factor - 1偽 ( HIF - 1偽 ) is a key regulator of HIF - 1偽 and HIF - 1尾, and its protein stability and transcriptional activity are highly regulated by oxygen concentration .
HIF - 1偽has a biological function . HIF - 1偽is regulated by oxygen dependent degradation domain ( ODDD ) and transcriptional activation domain ( Transactivation Domains ) . HIF - 1偽is regulated by oxygen dependent degradation domain ( ODDD ) and transcriptional activation domain ( Transactivation Domains ) . At the same time , the expression of HIF - 1偽gene is regulated by ubiquitination , and the expression vector ( pcDNA - ( 3.1 + ) - HIF - 1偽 - Triple ) of HIF - 1偽 has been successfully constructed .
The effects of p53RFP on HIF - 1偽 mRNA were investigated by means of RT - PCR . The expression of HIF - 1偽 in p53RFP and pcDNA - 3.1 ( + ) - HIF - 1偽 protein was significantly higher than that of pcDNA - 3.1 ( + ) - HIF - 1偽 - triple group . The p53RFP can be directly combined with HIF - la and promote its ubiquitination modification and degradation . 4 . Under delayed hypoxia , the expression of HIF - 1偽 in p53RFP is negatively regulated by histone deacetylating enzymes HDAC1 and HDAC1 .
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R36

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4 王W，

本文編號：1911555