本文選題：低氧誘導(dǎo)因子-1α + p53RFP�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：一、研究背景缺血性疾病(冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦血管疾病、外周血管缺血性疾病)已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的重大疾病。因此,對(duì)于缺血性疾病,探索新的治療方法和途徑就顯得有一定的必要性。近年來(lái),治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)為治療缺血性疾病的治療提供了一個(gè)新的方向。在治療性血管新生中,選擇作用于血管新生不同階段的幾種因子聯(lián)合應(yīng)用或先后序貫性治療,或者選擇觸發(fā)血管新生的“主開關(guān)”的因子,可能取得更為明顯的療效。缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)為上游細(xì)胞對(duì)低氧或缺氧,作出適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子,已證實(shí)能誘導(dǎo)多達(dá)100多種轉(zhuǎn)錄因子,立體地調(diào)整血管生成,為血運(yùn)重建治療開辟新的思路。因此,HIF-1α是個(gè)十分有應(yīng)用前景的治療因子,在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,得到了更多的重視。目前已經(jīng)明確了HIF-1的結(jié)構(gòu)和調(diào)控位點(diǎn),它是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成異二聚體。其中,HIF-1α是HIF-1能否發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)單位,其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性受氧濃度的高度調(diào)節(jié)；HIF-1β為組成性成分。在低氧條件下,HIF-1α表達(dá)水平增加,與HIF-1β形成異二聚體,從而具有生物學(xué)功能。HIF-1α穩(wěn)定性和活性受氧濃度的調(diào)節(jié),是由于HIF-1α含有氧依賴降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain, ODDD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Transactivation Domains)。常氧情況下,ODDD區(qū)Pro402和／或Pro564被脯氨酸羥化酶(prolylhydroxylase, PH)羥化后,被VHL腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumor suppressor)復(fù)合物識(shí)別,通過(guò)泛素蛋白酶途徑降解。同時(shí),HIF-1抑制因子(factor inhibiting HIF-1α,FIH)與HIF-1α C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(C-TAD)結(jié)合,通過(guò)803位點(diǎn)天冬酰胺殘基(Asn803)的羥化,阻止C-TAD與輔助激活因子(CBP/p300)結(jié)合,從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。在前期的研究中,本課題組已將HIF-1α的564、402、803三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合定點(diǎn)突變,成功構(gòu)建了三突變型HIF-1α-Triple表達(dá)載體(pcDNA-(3.1+)-HIF-1α-Triple),使其在常氧下能夠穩(wěn)定高效表達(dá),為單因素研究HIF-1α基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。p53RFP是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的一個(gè)重要基因,受p53基因的調(diào)控,其產(chǎn)物具有E3泛素連接酶活性,通過(guò)泛素化降解凋亡重要啟動(dòng)信號(hào)p21WAF1參與細(xì)胞增殖和凋亡,從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。目前對(duì)這個(gè)基因的研究較少。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)增加時(shí),p53RFP基因表達(dá)上調(diào)。而作為具有E3泛素連接酶活性的p53RFP,是否能夠和HIF-1α特異性識(shí)別,啟動(dòng)HEF-1α的泛素化降解途徑,以及可能存在的機(jī)制,并未有相關(guān)報(bào)道。二、研究目的本研究擬通過(guò)驗(yàn)證p53RFP與HIF-1α的降解是否存在關(guān)系；進(jìn)而探索其中可能存在的機(jī)制和通路,為進(jìn)一步研究可能對(duì)此過(guò)程進(jìn)行干預(yù),使得HIF-1α在機(jī)體缺血低氧的環(huán)境中,發(fā)揮良性作用奠定理論基礎(chǔ)。三、研究方法1、SW480細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(1%O2,94% N2,5% CO2),在低氧培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn),檢測(cè)HIF-1α和p53RFP蛋白表達(dá)水平,明確兩種蛋白在延遲低氧的條件下,是否都存在降解過(guò)程,推斷兩者可能存在的關(guān)系。2、加入蛋白酶抑制劑MG132,明確HIF-1α在延遲低氧環(huán)境下,是否通過(guò)泛素蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。3、通過(guò)干擾試驗(yàn),阻斷和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)p53RFP的表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α在延遲低氧條件下的降解,是否和p53RFP相關(guān)。4、通過(guò)RT-PCR的方法,證實(shí) p53RFP對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平是否存在影響。5、通過(guò)在常氧條件下,應(yīng)用三突變型HIF-1α真核表達(dá)載體,證明p53RFP對(duì)HIF-1α的降解調(diào)節(jié)功能,是否依賴于VHL。6、通過(guò)在低氧條件下,應(yīng)用p53抑制劑,探究p53RFP對(duì)HIF-1α的降解調(diào)節(jié)功能,是否依賴于p53。7、通過(guò)免疫共沉淀方法,驗(yàn)證p53RFP是否通過(guò)泛素化方式和HIF-1α結(jié)合,進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)HIF-1α降解的作用。8、通過(guò)在低氧條件下,應(yīng)用組蛋白去乙酰化酶抑制劑,探究p53RFP對(duì)HIF-1α的降解調(diào)節(jié)功能,是否有組蛋白去乙�；窰DAC1和HDAC2的參與。9、通過(guò)在低氧條件下,應(yīng)用HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA,進(jìn)一步探究組蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2參與p53RFP對(duì)HIF-1α的降解,是否與HIF-1α的乙�；潭认嚓P(guān)。四、結(jié)果第一部分：HIF-1α的蛋白水平在低氧誘導(dǎo)后開始增加,在觀察的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi),6小時(shí)左右HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)的達(dá)到最高峰,隨后的12,18,24小時(shí)內(nèi)HIF-1α發(fā)生降解,并最終維持在較低的表達(dá)水平。在檢測(cè)內(nèi)源性p53RFP蛋白表達(dá)時(shí),發(fā)現(xiàn)隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),p53RFP的表達(dá)也有一定幅度的增加。在加入蛋白酶抑制劑MG132后,HIF-1α的表達(dá)明顯上升,不同濃度的蛋白酶抑制劑MG132的阻斷HIF-1α降解效果,隨著濃度的增加,更加明顯。第二部分：與SW480細(xì)胞單獨(dú)低氧處理24小時(shí)組相比,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源p53RFP質(zhì)粒(1,2和6μg)的細(xì)胞其胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解更為明顯,且p53RFP的表達(dá)量越高,促進(jìn)HIF-1α蛋白的降解作用越明顯。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源p53RFP SiRNA (976) 1,2,6ug的細(xì)胞其胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解更不明顯,且p53RFP的表達(dá)量越低,減少HIF-1α蛋白的降解作用越明顯。常氧和延遲低氧條件下,轉(zhuǎn)染p53RFP與否,HIF-1α mRN A含量未發(fā)生明顯變化。第三部分：p53RFP和pcDNA-3.1 (+)-HIF-1α-triple轉(zhuǎn)染組與pcDNA-3.1(+)-HIF-1α-triple組相比,HIF-1α表達(dá)量明顯降低,降解增多,同時(shí)p53RFP的表達(dá)增加。p53RFP轉(zhuǎn)染組與是否加入p53抑制劑相比,p53RFP和HIF-1α的表達(dá)量無(wú)明顯改變,和未加任何干擾因素相比,p53RFP明顯升高,HIF-1α明顯降低。隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng),伴隨著其蛋白水平的降解,HIF-1α的乙酰化和泛素化修飾水平均逐漸增強(qiáng)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同濃度的p53RFP質(zhì)粒1,2,6ug,經(jīng)低氧培養(yǎng)24小時(shí)后,結(jié)果提示在低氧狀態(tài)下p53RFP可以與HIF-1α直接結(jié)合,并促進(jìn)其泛素化修飾和降解。p53RFP轉(zhuǎn)染組與是否加入組蛋白去乙�；敢种苿┫啾�,HIF-1α的表達(dá)量明顯下降。p53RFP轉(zhuǎn)染組與是否加入HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA組相比, HIF-1α的乙�；潭仍黾�,與p53RFP結(jié)合增加,HIF-1α的降解也增加。五、結(jié)論第一部分：1.在延遲低氧的條件下,HIF-1α的表達(dá),在初期(6小時(shí)左右)呈逐漸上升,隨后隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),HIF-1α發(fā)生了降解,并維持在低水平。在相同條件下,p53RFP的表達(dá)呈逐漸增加。2.延遲低氧條件下,HIF-1α的降解是通過(guò)泛素-蛋白酶體通路。第二部分：1.延遲低氧條件下,細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53RFP質(zhì)粒后,p53RFP表達(dá)增加,促進(jìn)了HIF-1α降解,p53RFP的表達(dá)和HIF-1α的降解存在正相關(guān)性。2.延遲低氧條件下,沉默p53RFP表達(dá)后,p53RFP表達(dá)減少,減少了HIF-1α降解,進(jìn)一步證實(shí)p53RFP的表達(dá)和HIF-1α的降解存在正相關(guān)性。3.常氧和延遲低氧條件下,p53RFP對(duì)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響。第三部分：1.p53RFP能夠促進(jìn)三突變HIF-1α的降解。2.延遲低氧條件下,p53RFP參與的HIF-1α降解是VHL和p53非依賴的。3.延遲低氧條件下,p53RFP可以與HIF-la直接結(jié)合,并促進(jìn)其泛素化修飾和降解。4.延遲低氧條件下,p53RFP參與的HIF-1α降解受到組蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2的負(fù)調(diào)控作用。
[Abstract]:Hypoxia - inducible factor - 1偽 ( HIF - 1偽 ) is a key regulator of HIF - 1偽 and HIF - 1尾, and its protein stability and transcriptional activity are highly regulated by oxygen concentration .
HIF - 1偽has a biological function . HIF - 1偽is regulated by oxygen dependent degradation domain ( ODDD ) and transcriptional activation domain ( Transactivation Domains ) . HIF - 1偽is regulated by oxygen dependent degradation domain ( ODDD ) and transcriptional activation domain ( Transactivation Domains ) . At the same time , the expression of HIF - 1偽gene is regulated by ubiquitination , and the expression vector ( pcDNA - ( 3.1 + ) - HIF - 1偽 - Triple ) of HIF - 1偽 has been successfully constructed .
The effects of p53RFP on HIF - 1偽 mRNA were investigated by means of RT - PCR . The expression of HIF - 1偽 in p53RFP and pcDNA - 3.1 ( + ) - HIF - 1偽 protein was significantly higher than that of pcDNA - 3.1 ( + ) - HIF - 1偽 - triple group . The p53RFP can be directly combined with HIF - la and promote its ubiquitination modification and degradation . 4 . Under delayed hypoxia , the expression of HIF - 1偽 in p53RFP is negatively regulated by histone deacetylating enzymes HDAC1 and HDAC1 .
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R36

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4 王W，

本文編號(hào)：1911555