本文選題：金黃色葡萄球菌 + 非編碼RNA��； 參考：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：金黃色葡萄球菌是典型的革蘭氏陽性條件致病菌,在環(huán)境中分布廣泛。近年來,金黃色葡萄球菌已成為主要的臨床感染菌,醫(yī)院內(nèi)每年都會(huì)有數(shù)以百萬的金黃色葡萄球菌感染發(fā)生。金黃色葡萄球菌感染能夠引發(fā)的癥狀有食物中毒、潰瘍、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等,甚至引起敗血性休克而導(dǎo)致死亡。金黃色葡萄球菌之所以能引起如此多的病癥,是因?yàn)樗芊置诙喾N致病因子,其中a溶血素是非常重要的毒素之一。在感染過程中,這些毒性因子受到了廣泛而精細(xì)的調(diào)控,從而幫助細(xì)菌響應(yīng)和適應(yīng)各種復(fù)雜的環(huán)境。這些調(diào)控因子包括二元信號(hào)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白和非編碼RNA等。 我們?cè)谇捌谘芯縇uxS/AI-2信號(hào)系統(tǒng)時(shí),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與luxS反向重復(fù)的sRNA。Northern blot和RACE分析證實(shí),這個(gè)sRNA全長為345nt,并將其命名為ArtR。序列分析和RT-PCR等實(shí)驗(yàn)表明,ArtR是金黃色葡萄球菌中所特有的一種sRNA,它的表達(dá)受到Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的抑制。但是這種抑制效應(yīng)不是通過Agr群體感應(yīng)系統(tǒng)常用的RNAIII來實(shí)現(xiàn),而是直接通過AgrA蛋白與ArtR的啟動(dòng)子相互作用來實(shí)現(xiàn)�；蚯贸龑�(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ArtR的缺失影響了金黃色葡萄球菌α溶血素的水平。而凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)證明,ArtR并不能直接結(jié)合α溶血素的mRNA。于是我們尋找了a溶血素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)現(xiàn)ArtR突變株中α溶血素的抑制因子SarT的水平有所升高。通過凝膠阻滯分析和RNA酶解等實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)ArtR通過與sarT5'UTR上的一段區(qū)域與相互作用,促進(jìn)了RNase Ⅲ對(duì)sarT mRNA的降解。這項(xiàng)研究鑒定了金黃色葡萄球菌屬中一個(gè)新的毒性相關(guān)的sRNA,并且闡明它是通過與轉(zhuǎn)錄因子mRNA相互作用來實(shí)現(xiàn)其調(diào)控過程的。 sRNA調(diào)控不僅局限于sRNA與靶RNA的相互作用,可能有很多蛋白質(zhì)參與其中。但是由于技術(shù)的限制,對(duì)金黃色葡萄球菌中sRNA相關(guān)的蛋白質(zhì)知之甚少。我們通過前期的研究工作成功建立了利用tRNA融合RNA適配體(簡稱tRSA)進(jìn)行sRNA蛋白質(zhì)pull-down的實(shí)驗(yàn)體系,選取了金黃色葡萄球菌中重要的sRNA——RNAIII,對(duì)其結(jié)合蛋白進(jìn)行釣取。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)tRSA標(biāo)記的RNA能夠較好被鏈霉親和素磁珠捕獲,用這個(gè)體系成功釣取了81個(gè)能夠結(jié)合RNAⅢ的候選蛋白質(zhì)。我們進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)表達(dá)、凝膠阻滯分析驗(yàn)證了這些候選蛋白與RNAⅢ的結(jié)合能力。選取的9個(gè)蛋白質(zhì)中,RNase Ⅲ對(duì)RNAⅢ具有降解活性,7個(gè)蛋白(CshA、RNase J2、Era、Hu、WalR、PyK、FtsZ)可以結(jié)合RNAⅢ,PflcA沒有檢測出結(jié)合能力。同時(shí)選取了兩個(gè)pull-down未鑒定出的,但屬于RNA降解體的蛋白,發(fā)現(xiàn)它們并不能夠直接結(jié)合RNAⅢ。該實(shí)驗(yàn)表明金黃色葡萄球菌中可能有很多蛋白質(zhì)結(jié)合RNAⅢ,并有可能參與它的調(diào)控過程；tRSA的體系能夠很好的運(yùn)用于金黃色葡萄球菌sRNA結(jié)合蛋白的pull-down實(shí)驗(yàn),并且成功鑒定出部分RNAⅢ的結(jié)合蛋白質(zhì)。深入研究這些蛋白質(zhì)對(duì)于sRNA調(diào)控以及金黃色葡萄球菌致病性調(diào)控的作用,能夠深化我們對(duì)細(xì)菌sRNA調(diào)控機(jī)制和復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。
[Abstract]:Staphylococcus aureus is a typical gram positive condition pathogenic bacteria and is widely distributed in the environment. In recent years, Staphylococcus aureus has become the main clinical infection bacteria. In hospitals, millions of Staphylococcus aureus infection occurs every year in hospitals. The symptoms of Staphylococcus aureus can be caused by food poisoning and ulcers. Endocarditis, osteomyelitis, pneumonia, and even septic shock cause death. Staphylococcus aureus can cause so many diseases because it can secrete a variety of pathogenic factors, in which a hemolysin is one of the most important toxins. In the process of infection, these toxic factors are widely and finely regulated. It helps bacteria respond to and adapt to various complex environments. These regulatory factors include two element signal system, transcriptional regulatory protein and non coding RNA.
In our previous study of the LuxS/AI-2 signal system, we found a sRNA.Northern blot and RACE analysis that repeats the reverse of luxS. This sRNA full length is 345nt, and it is named ArtR. sequence analysis and RT-PCR and other experiments show that ArtR is a kind of sRNA in Staphylococcus aureus, and its expression is subjected to the Agr population induction system. But this inhibitory effect was not realized by the common RNAIII of the Agr quorum sensing system, but was realized directly through the interaction of the AgrA protein with the promoter of ArtR. The gene knockout experiment found that the deletion of ArtR affected the level of the alpha hemolysin of Staphylococcus aureus. And the gel block analysis proved that ArtR was not. Directly combining mRNA. with alpha hemolysin we searched for the transcription factors associated with a hemolysin, and found that the level of the inhibitory factor SarT of alpha hemolysin in the ArtR mutant was elevated. Through gel block analysis and RNA enzymolysis experiments, we confirmed that ArtR has promoted RNase III to sarT mR through the interaction with a segment of sarT5'UTR. The degradation of NA. This study identified a new toxic related sRNA in the genus Staphylococcus and clarified that it was regulated by interaction with the transcription factor mRNA.
SRNA regulation is not only limited to the interaction between sRNA and target RNA, and there may be a lot of proteins involved. But because of the limitations of technology, there is little knowledge about sRNA related proteins in Staphylococcus aureus. We successfully established a tRNA fusion RNA aptamer (tRSA) for sRNA protein pull-down through previous research work. The experimental system selected the important sRNA - RNAIII in Staphylococcus aureus to catch the binding protein. The experiment found that the tRSA labeled RNA could be better captured by the streptomycin magnetic beads, and 81 candidate proteins that could be combined with RNA III were caught with this system. We further through protein expression, gel block The binding ability of these candidate proteins to RNA III was verified. Of the 9 proteins selected, RNase III had biodegradation activity to RNA III, and 7 proteins (CshA, RNase J2, Era, Hu, WalR, PyK, FtsZ) could be combined with RNA III and did not detect the binding ability. At the same time, two proteins were not identified, but the proteins belonging to the descending disaggregation were found. They are not able to combine RNA III directly. This experiment shows that there may be a lot of proteins associated with RNA III in Staphylococcus aureus and may be involved in its regulatory process. The system of tRSA can be well used in the pull-down experiment of Staphylococcus aureus sRNA binding protein and successfully identified some of the binding proteins of RNA III. A thorough study of the effects of these proteins on sRNA regulation and the pathogenicity of Staphylococcus aureus can deepen our understanding of the regulatory mechanism of bacterial sRNA and the complex network.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.11

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1906170