本文選題：剛地弓形蟲 + 活化蛋白激酶C受體　； 參考：《環(huán)境與健康雜志》2013年07期

【摘要】：目的克隆剛地弓形蟲活化蛋白激酶C受體1(TgRACK1)基因,原核表達(dá)、純化TgRACK1,并分析其抗原性。方法制備弓形蟲RH株速殖子總RNA,根據(jù)TgRACK1基因全長編碼序列(GenBank登錄號:AY547291)的開放閱讀框設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pGEX-6p-1載體,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α,陽性菌落經(jīng)菌液PCR、雙酶切及DNA測序進(jìn)行鑒定。將重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-TgRACK1轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá),以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測表達(dá)產(chǎn)物;分別以抗GST標(biāo)簽抗體和兔抗弓形蟲血清為一抗,免疫印跡(Western blotting)分析鑒定重組蛋白及其抗原性。重組融合蛋白經(jīng)GST瓊脂糖凝膠親和純化,純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離,考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)分析其純度。結(jié)果 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物約為970 bp,重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-TgRACK1構(gòu)建成功。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得相對分子質(zhì)量約63 kDa的可溶性重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)為帶GST標(biāo)簽的重組融合蛋白,且能被兔抗弓形蟲血清識別。親和純化后獲得純度大于95%的重組TgRACK1蛋白質(zhì)。結(jié)論克隆得到弓形蟲活化蛋白激酶C受體1基因,原核表達(dá)并純化出該基因編碼的蛋白質(zhì),且該重組蛋白具有抗原性。
[Abstract]:Objective to clone Toxoplasma gondii activated protein kinase C receptor 1 (TgRACK1) gene, express and purify TgRACK1 in prokaryotic, and analyze its antigenicity. Methods Toxoplasma gondii RH strain Toxoplasma gondii Toxoplasma gondii R@@ The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH5 偽. The positive colonies were identified by PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing. The recombinant plasmid pGEX-6p-1-TgRACK1 was transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) and was induced by isopropyl- 尾 -D- thiogalactoside (IPTG). The expression product was detected by SDSPAGE and Coomassie brilliant blue staining. The recombinant protein and its antigenicity were identified by Western blotting analysis with anti-Toxoplasma gondii antibody and anti-Toxoplasma gondii antibody as the first antibody. The recombinant fusion protein was purified by GST agarose gel affinity. The purified protein was separated by SDS-PAGE. Coomassie brilliant blue staining and gel imaging system were used to analyze its purity. Results the RT-PCR amplification product was about 970 BP, and the recombinant plasmid pGEX-6p-1-TgRACK1 was successfully constructed. The soluble recombinant protein with relative molecular weight of 63 kDa was obtained by IPTG induction. The expressed protein is a recombinant fusion protein with GST tag and can be recognized by rabbit antitoxoplasma serum. After affinity purification, recombinant TgRACK1 protein with purity greater than 95% was obtained. Conclusion Toxoplasma gondii activated protein kinase C receptor 1 gene was cloned, and the protein encoded by this gene was expressed and purified in prokaryotic expression, and the recombinant protein was antigenicity.
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室;山西醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81071374) 山西省高�？萍佳芯块_發(fā)項(xiàng)目(20111010) 山西醫(yī)科大學(xué)科技創(chuàng)新基金(01201103) 山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院331科技啟動基金(201202)
【分類號】：R382

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本文編號：1896954