發(fā)布時(shí)間：2018-05-14 11:47

  本文選題：噬菌體肽庫 + B細(xì)胞表位��； 參考：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：塵螨是引起變應(yīng)性疾病的主要變應(yīng)原,用塵螨變應(yīng)原提取物進(jìn)行臨床檢測和特異性免疫治療應(yīng)用廣泛。然而塵螨提取物受原材料和提取技術(shù)等因素的影響,在蛋白成分、含量及純度等方面差異性大,直接影響了臨床診斷的準(zhǔn)確性以及特異性免疫治療的療效和安全性。本研究中,我們拋開對變應(yīng)原本身的研究,用塵螨變應(yīng)原陽性患者血清中針對塵螨的特異性IgE抗體為釣餌,進(jìn)行由果到因的反推。通過噬菌體展示隨機(jī)肽技術(shù)進(jìn)行陰陽雙重篩選,得出與塵螨特異性IgE結(jié)合的模擬肽。首先用塵螨變應(yīng)原IgE陰性的過敏患者血清中IgE進(jìn)行陰性篩選排除IgE保守的重鏈結(jié)合肽,再用塵螨陽性患者血清中IgE為釣餌,得到和IgE抗體高變區(qū)結(jié)合的塵螨B細(xì)胞線性以及構(gòu)象表位模擬肽庫。為了驗(yàn)證篩選的塵螨B細(xì)胞表位模擬肽的體內(nèi)生物學(xué)功能,我們利用戶塵螨誘發(fā)的變應(yīng)性鼻炎伴支氣管哮喘小鼠模型,觀察所篩選的塵螨B細(xì)胞表位模擬肽1,2與3對小鼠模型氣道炎癥的治療作用,為進(jìn)一步研制和開發(fā)塵螨特異性免疫治療的B細(xì)胞表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一、與塵螨IgE結(jié)合的噬菌體的篩選1、噬菌體的親和篩選：以塵螨IgE陰性的過敏患者血清IgE為誘餌進(jìn)行陰性篩選,獲得不能結(jié)合的噬菌體,然后再以塵螨陽性患者血清IgE抗體為誘餌進(jìn)行陽性篩選,選出能夠結(jié)合的噬菌體。在篩選過程中,通過降低釣餌的濃度、減少釣餌與肽庫作用時(shí)間、增加洗脫強(qiáng)度,去除不能與塵螨IgE結(jié)合和與塵螨IgE結(jié)合較弱的噬菌體,經(jīng)三輪篩選后得到富集程度較高的分別與塵螨IgE特異性結(jié)合的噬菌體克隆。2、挑選與IgE特異性結(jié)合的噬菌體克�。簭慕�(jīng)過陰性和陽性篩選后的洗脫物中隨機(jī)挑選出100個(gè)噬菌體單克隆,通過ELISA技術(shù)進(jìn)一步鑒定其與塵螨IgE結(jié)合的特異性,結(jié)果得到84個(gè)能與塵螨IgE特異性結(jié)合的噬菌體。3、DNA測序與多肽合成：將84個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行DNA測序后,除去相同序列以及克隆無效的序列,最后獲得44個(gè)噬菌體克隆。將這44個(gè)噬菌體單克隆的DNA序列與塵螨主要變應(yīng)原分子Der p1, Der p2, Der p5與Der p7的三維結(jié)構(gòu)通過軟件比對,將3個(gè)特異性強(qiáng)且氨基酸序列與塵螨主要變應(yīng)原比對性高的噬菌體單克隆合成模擬肽。二、 戶塵螨模擬環(huán)肽對實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎伴支氣管哮喘模型的作用以戶塵螨誘導(dǎo)的變應(yīng)性鼻炎伴哮喘的小鼠為模型,觀察3個(gè)合成模擬肽在體內(nèi)對變應(yīng)性鼻炎伴支氣管哮喘的干預(yù)作用,設(shè)正常對照組,變應(yīng)性鼻炎伴哮喘模型組以及模擬肽干預(yù)組1/2/3。100μ1戶塵螨提取液滴鼻致敏后,正常對照組以生理鹽水滴鼻激發(fā),模型組與模擬肽干預(yù)組以100μ1戶塵螨提取液激發(fā)。模擬肽干預(yù)組采用合成肽(500μg合成肽+200μ1 PBS)溶液皮下注射連續(xù)給藥干預(yù)(1次／天)4天。再次激發(fā)后處死小鼠,進(jìn)行一系列觀察與檢測,結(jié)果如下：1、模擬肽干預(yù)組小鼠的抓鼻、流清涕、打噴嚏的癥狀明顯改善,無口唇發(fā)紺、喘氣以及呼吸頻率加快等癥狀。2、模擬肽干預(yù)組氣道阻力較模型組明顯降低。3、模擬肽干預(yù)組鼻黏膜上皮細(xì)胞完整,無柱狀和杯狀細(xì)胞增生,黏膜下層無腺體增生、無中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤,僅有少量嗜酸性粒細(xì)胞；模擬肽干預(yù)組肺組織血管與支氣管炎癥浸潤明顯減少、氣道上皮結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)。4、模擬肽干預(yù)組1、2、3鼻黏膜上皮IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明顯低于模型組；模擬肽干預(yù)組肺組織中IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明顯低于模型組。5、模擬肽干預(yù)組鼻腔與支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細(xì)胞均顯著低于模型組。6、鼻腔灌洗液：模擬肽干預(yù)組IL-4水平明顯低于模型組,干預(yù)組2、3 IL-10水平明顯高于模型組,干預(yù)組3中IL-25水平明顯低于模型組,干預(yù)組IFN-γ水平明顯高于模型組；肺泡灌洗液：模擬肽干預(yù)組IL-4水平明顯低于模型組,干預(yù)組1、3 IL-10水平明顯高于模型組,干預(yù)組IL-25水平明顯低于模型組,干預(yù)組1、2中IL-33水平明顯低于模型組,干預(yù)組1、3中IFN-γ水平明顯高于模型組。7、模擬肽干預(yù)組血清戶塵螨特異性IgE抗體水平明顯低于模型組,而IgG1抗體水平則明顯高于模型組。綜上所述,應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)成功篩選到塵螨B細(xì)胞表位模擬肽,且篩選到的模擬肽能顯著減輕塵螨誘導(dǎo)小鼠變應(yīng)性氣道炎癥的病理損傷,改善癥狀,有效抑制鼻腔與肺組織中炎性細(xì)胞的浸潤,減少促炎細(xì)胞因子的分泌,降低塵螨特異性IgE水平,提高保護(hù)性抗體IgG1水平。本研究為進(jìn)一步研制和開發(fā)塵螨特異性免疫治療的表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:In order to verify the biological function of IgE - specific binding peptide in serum of dust mite allergen - positive patients , we obtained 84 phage clones which can bind to the IgE - specific IgE antibody .
The levels of IL - 25 mRNA and IL - 33mRNA were significantly lower than those in model group .
The levels of IL - 25 mRNA and IL - 33mRNA were significantly lower in the model group than those in the model group . The levels of IL - 4 in the nasal cavity and the bronchial alveolar lavage fluid were significantly lower than those in the model group .
In conclusion , the levels of IL - 4 in the intervention group were significantly lower than those in the model group and the levels of IL - 25 in the intervention group were significantly lower than those in the model group .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392-33

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本文編號：1887728