本文選題：LKB1 + 毛細(xì)胞��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景LKB1基因編碼一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶,又被稱為STK11,它被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子,在個體生長發(fā)育和腫瘤發(fā)生過程中起至關(guān)重要的作用。Peutz-Jephers綜合征(PJS)是一種常染色體顯性遺傳病,被稱為皮膚黏膜色素沉著和胃腸道息肉綜合征,簡稱黑斑息肉綜合征。它的主要臨床表現(xiàn)為皮膚粘膜色素沉著和多發(fā)性錯構(gòu)瘤樣胃腸道息肉,并具有高度易感性。近年來,LKB1基因被公認(rèn)為是PJS的主要致病基因。然而,由于LKB1基因致病機(jī)制錯綜復(fù)雜,至今未能完全闡明。為了進(jìn)一步確定LKB1是否是PJS綜合征的關(guān)鍵致病基因,并檢測LKB1基因的生物學(xué)功能,2002年,Jishage et al等人制作了一個Lkbl基因敲除小鼠。在LKB1純合敲除小鼠中,他們發(fā)現(xiàn)LKB1純合敲除小鼠死于妊娠中期,約胚胎期8.5至9.5(E8.5-9.5)天,表現(xiàn)出胚胎神經(jīng)管缺陷,間充質(zhì)細(xì)胞死亡和血管異常等。在交配后9.5天時,與同窩小鼠胚胎相比,純合敲除小鼠胚胎體型較小,并且發(fā)育遲緩。另外,在10-14個月的雜合突變小鼠中,發(fā)現(xiàn)多處胃腸息肉。這些結(jié)果都暗示了Lkbl基因在小鼠胚胎發(fā)生以及發(fā)育過程中是必不可少的,與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。目前,作為一個腫瘤抑制因子,LKB1已經(jīng)成為研究熱點(diǎn),深受研究者們的青睞。LKBl基因表達(dá)廣泛,幾乎在所有組織中均有表達(dá),其中在上皮、胃、腸和睪丸生精小管等組織器官中表達(dá)水平較高。由于LKB1基因的廣泛表達(dá)和重要的生物學(xué)功能,因此LKB1全身性敲除小鼠在胚胎期致死,從而大大阻礙了在體內(nèi)對LKB1生物學(xué)功能的研究。近年來,為了能更好的研究LKB1基因在體內(nèi)的生物學(xué)功能,已經(jīng)有不少條件敲除小鼠模型被相繼制作。現(xiàn)已報道LKB1基因在體內(nèi)能夠介導(dǎo)TGF-β、NF-κB、PTEN/PI3K、G蛋白偶聯(lián)、mTOR等多條信號通路,在細(xì)胞生長調(diào)控中發(fā)揮重要作用。LKBl參與調(diào)控多種細(xì)胞活動,包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞極性建立、染色質(zhì)重構(gòu)以及能量代謝等。但是,Lkbl基因在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的研究還不夠深入,在內(nèi)耳和小腦發(fā)育中的功能均未見報道。因此,在本論文中,我們利用LKB1條件敲除小鼠研究了Lkbl基因在小鼠內(nèi)耳和小腦發(fā)育中的功能及其的分子機(jī)制。擬解決的科學(xué)問題本論文利用條件性基因敲除技術(shù),獲得兩種Lkbl基因特異性敲除小鼠,即Pax2-LKB1條件敲除小鼠和Atohl-LKB1條件敲除小鼠。利用這兩種敲除小鼠模型,我們研究了Lkbl基因在小鼠內(nèi)耳和小腦發(fā)育過程中重要的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制。擬解決的科學(xué)問題為：(1)LKB1在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育中的作用；(2)LKB1調(diào)節(jié)內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育的分子機(jī)制；(3)LKB1在小鼠小腦發(fā)育及腦葉形成中的功能；(4)LKBl調(diào)節(jié)小腦發(fā)育及腦葉形成中的分子機(jī)制。研究方案及取得的成果本論文為了解決以上科學(xué)問題,我們以小鼠為實(shí)驗(yàn)材料,利用Cre-LoxP系統(tǒng),首先制作了Pax2-Cre介導(dǎo)的LKB1特異性敲除的小鼠模型,即Pax2-LKB1條件敲除小鼠。在本論文中,我們首先利用Pax2-LKB1條件敲除小鼠,研究了Lkbl基因在內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育中重要的生物學(xué)功能。Pax2-Cre表達(dá)時間較早,大約在胚胎期7-8天時表達(dá)并將Lkbl基因在內(nèi)耳中特異性剔除。在研究中,我們發(fā)現(xiàn),一小部分Pax2-LKB1條件敲除小鼠在胚胎期死亡,另一部分小鼠在出生前E18.5天時仍然存活,但出生時致死,小鼠個體之間存在一定差異。所有的Pax2-LKB1條件敲除小鼠胚胎均蒼白無血色。為了研究Lkbl基因在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育中的功能,我們使用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)免疫熒光染色技術(shù)檢測了在胚胎期17.5-18.5天的耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛束的形態(tài)。結(jié)果顯示,在野生型小鼠中,耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛束呈整齊的V字形,且V字形開口一致。然而,在Pax2-LKB1條件敲除小鼠中,耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛束呈聚集狀態(tài),且靜纖毛束朝向紊亂。我們用動纖毛的標(biāo)記物Tubulin對小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞動纖毛進(jìn)行了免疫熒光染色。結(jié)果顯示,在野生型小鼠中,動纖毛位置統(tǒng)一,均位于毛細(xì)胞頂表面?zhèn)冗叺闹虚g,且位于靜纖毛束V字形的頂點(diǎn)。但是,在Pax2-LKB1條件敲除小鼠中,動纖毛定位異常,定位于毛細(xì)胞頂表面?zhèn)冗叺碾S意位置。接下來,我們利用掃描電鏡技術(shù)更清楚的觀察了內(nèi)耳毛細(xì)胞聽纖毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果同樣顯示在Pax2-LKB1條件敲除小鼠中,靜纖毛形態(tài)紊亂,V字形朝向隨意。大部分動纖毛仍然定位于靜纖毛束V字形的頂點(diǎn),但動纖毛沒有規(guī)則的定位到毛細(xì)胞頂表面?zhèn)冗叺闹行�。在個別毛細(xì)胞中動纖毛沒有定位在V字形的頂點(diǎn)處,動纖毛的定位出現(xiàn)了一定偏差。在毛細(xì)胞聽纖毛的發(fā)育過程中,動纖毛的遷移常常決定了靜纖毛束的定位和朝向。靜纖毛V字形的朝向是毛細(xì)胞平面極性(PCP)的重要標(biāo)志。因此,我們提出在早期胚胎發(fā)育過程中,LKB1對小鼠耳蝸毛細(xì)胞平面極性的建立起重要作用。由于Pax2-Cre介導(dǎo)的Pax2-LKB1條件敲除小鼠胚胎期致死,使我們不能對Lkbl基因在內(nèi)耳中的功能進(jìn)行深入研究。因此,我們選擇另一種Atoh1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠,制作了Atoh1-LKB1內(nèi)耳特異性敲除小鼠。由于Atohl-Cre較Pax2-Cre的表達(dá)時間晚,大約在胚胎期13.5-14.5天時表達(dá),Atoh1-LKB1條件敲除小鼠可存活至成體,且發(fā)育良好。利用Atoh1-LKB1特異性敲除小鼠,我們進(jìn)一步研究了LKB1在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育和成熟過程中的重要功能及其可能的致病機(jī)制。與同窩成體野生型小鼠相比,Atoh1-LKB1條件敲除小鼠的體型較小,且體重較輕,但是在整體形態(tài)上沒有表現(xiàn)出明顯的異常。在聽力的檢測中發(fā)現(xiàn),Atoh1-LKB1敲除小鼠的聽力損失嚴(yán)重。為了進(jìn)一步檢測Lkbl基因在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育中的功能,我們運(yùn)用Phalloidin的免疫熒光染色技術(shù)檢測了小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中,在P1天時,內(nèi)毛細(xì)胞和外毛細(xì)胞的聽纖毛有輕微的異常,但不明顯。然而,在P7天時,外毛細(xì)胞的靜纖毛呈現(xiàn)U字形且階梯狀形態(tài)紊亂。在P7天之后,Atoh1-LKB1敲除小鼠的耳蝸外毛細(xì)胞靜纖毛的紊亂程度加重。另外,我們還發(fā)現(xiàn)在P14天時外毛細(xì)胞開始出現(xiàn)零星丟失的現(xiàn)象。鑒于耳蝸毛細(xì)胞表型出現(xiàn)的時間差,我們認(rèn)為Lkbl基因的缺失可能直接引起毛細(xì)胞靜纖毛的形態(tài)和功能的異常,最終導(dǎo)致內(nèi)耳毛細(xì)胞的缺失。內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛的核心結(jié)構(gòu)是由緊密組裝的單極性肌動蛋白絲和若干肌動蛋白連接蛋白組成,如ERM(ezrin/radixin/moesin)蛋白家族、villin、fimbrin、 XIRP2和]FASCIN2等。這些肌動蛋白連接蛋白參與肌動蛋白為基礎(chǔ)的骨架結(jié)構(gòu)的組裝,可以維持靜纖毛的穩(wěn)定性,對毛細(xì)胞靜纖毛束的形態(tài)發(fā)生起重要作用。在本研究中,我們檢測了肌動蛋白連接蛋白ERM。使用免疫熒光的方法檢測到ERM蛋白主要表達(dá)在小鼠耳蝸毛細(xì)胞的靜纖毛上。Western blot結(jié)果顯示在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中,與ERM的蛋白表達(dá)水平相比,p-ERM有明顯的下降。我們推測,在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中,p-ERM表達(dá)水平的明顯下降很可能是毛細(xì)胞靜纖毛中肌動蛋白組裝失敗的一個重要原因。據(jù)報道在小腸上皮細(xì)胞中,LKB1可以通過控制Mst4間接地磷酸化激活ERM家族成員中的Ezrin�；罨膒-Ezrin進(jìn)而能調(diào)節(jié)小腸上皮細(xì)胞刷狀緣結(jié)構(gòu)的形成。由于小腸上皮刷狀緣結(jié)構(gòu)與內(nèi)耳聽纖毛結(jié)構(gòu)類似,都是有肌動蛋白絲組裝而成的。因此,我們進(jìn)一步檢測了在小鼠內(nèi)耳中Mst4的表達(dá)。結(jié)果顯示,Mst4在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞中表達(dá)水平較高。Western blot結(jié)果顯示在Atohl-LKB1條件敲除小鼠中,LKB1敲除后使Mst4的蛋白表達(dá)水平明顯下降。因此,我們推測Mst4可能作為LKB1和ERM的中間調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)內(nèi)耳毛細(xì)胞聽纖毛的發(fā)育和維持。綜上所述,在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞發(fā)育過程中,LKB1可以通過激活ERM家族蛋白調(diào)節(jié)耳蝸毛細(xì)胞靜纖毛的發(fā)育和維持,進(jìn)而保證正常的聽覺功能。由于Atohl-Cre不僅在內(nèi)耳中表達(dá),而且在小腦中也有表達(dá)。因此,我們選擇Atohl-LKB1條件敲除小鼠繼續(xù)研究了Lkbl基因在小鼠小腦中的功能。在本論文中,我們研究了在小鼠小腦發(fā)育中,LKB1在小腦發(fā)育和腦葉形成中的重要功能及其分子機(jī)制。小腦是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的組成部分,參與更高水平的功能,包括認(rèn)知,情感,語言處理以及運(yùn)動協(xié)調(diào)等能力。在本論文中,我們首先采用了一系列行為學(xué)實(shí)驗(yàn),包括步態(tài)檢測、滾筒試驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn),檢測了Atohl-LKB1條件敲除小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力。結(jié)果顯示,Atoh1-LKB1條件敲除小鼠的運(yùn)動協(xié)調(diào)能力明顯下降。與成體野生型小鼠相比,Atohl-LKB1條件敲除小鼠的小腦容積增大,腦小葉增多,小腦復(fù)雜程度明顯增加。據(jù)研究報道,小腦腦葉的形成與顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖緊密相關(guān)。隨后,我們利用增殖細(xì)胞的標(biāo)記物PH3和BrdU的免疫熒光染色的方法檢測發(fā)現(xiàn)Atohl-LKB1條件敲除小鼠小腦顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞(GCPs)過度增殖。BrdU追蹤實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中,LKB1的敲除影響了顆粒細(xì)胞正常遷移至內(nèi)顆粒細(xì)胞層。因此,在小鼠小腦發(fā)育過程中,Lkbl基因的缺失不僅引起了顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞增殖的加快,而且也影響了顆粒細(xì)胞的正常遷移。另外,我們也發(fā)現(xiàn)在Atohl-LKB1條件敲除小鼠小腦中,浦肯野細(xì)胞發(fā)育不良,部分區(qū)域呈聚集狀態(tài)。這些異常的表型暗示了LKB1在小腦發(fā)育中起著重要的作用。根據(jù)之前的研究報道,Shh信號對顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的快速增殖有重要作用。Shh信號是通過由其下游的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Gli家族來調(diào)節(jié)的。在本研究中,我們檢測了Gli1、Gli2和Gli3的表達(dá),Western blot結(jié)果顯示在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中,G1i家族基因的表達(dá)水平明顯上升,這表明了Shh信號的增強(qiáng)。Cyclin D1是Shh信號下游的靶蛋白,在顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞增殖過程中,Cyclin D1能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。在本研究中,我們也發(fā)現(xiàn)在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中Cyclin D1的表達(dá)水平升高。因此,這些結(jié)果揭示了在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中,LKB1缺失引起了Shh信號和CyclinD1的表達(dá)上調(diào),最終導(dǎo)致了顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的過度增殖。為了進(jìn)一步確定Lkbl基因是否通過Shh信號調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖,我們利用Shh信號抑制劑在體外檢測了顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖情況。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體內(nèi)的結(jié)果一致,結(jié)果顯示了LKB1可能通過控制Shh信號水平調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖。據(jù)報道AMPK能夠作為LKB1的直接的下游靶蛋白激活多種信號通路；在體外AMPK可以與Glil相互作用負(fù)調(diào)控Shh信號。在我們的研究中,Western blot結(jié)果顯示,在Atoh1-LKB1條件敲除小鼠中總的AMPK表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異,但是磷酸化的AMPK的水平明顯下降。因此,AMPK很有可能作為LKB1和Shh信號的中間調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)小腦的正常發(fā)育。綜上所述,在小腦發(fā)育過程中,LKB1可以通過控制Shh信號介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖和顆粒細(xì)胞的遷移來調(diào)節(jié)小腦發(fā)育和腦葉形成。研究意義本論文利用LKBl特異性敲除小鼠模型,闡明了Lkbl基因在小鼠內(nèi)耳和小腦發(fā)育過程中起重要功能,從細(xì)胞水平和分子水平上揭示了LKB1調(diào)節(jié)耳和小腦發(fā)育的機(jī)制,為進(jìn)一步研究哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育提供了理論依據(jù)。此外,神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病是一類常見疾病并且在醫(yī)學(xué)界很難治愈。在人類神經(jīng)系統(tǒng)中存在很多與內(nèi)耳和小腦相關(guān)的疾病包括耳聾,運(yùn)動能力失調(diào),小腦蚓體發(fā)育不良等,然而這些疾病的診斷和發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚。本研究制作的Atohl-LKB1條件敲除小鼠可以作為人類疾病的理想模型為哺乳動物聽力損失和小腦中相關(guān)疾病的臨床診斷和治療提供新的思路,具有一定的指導(dǎo)意義。我們也可以從這些病人中,特別是PJS綜合征病人中篩選是否存在LKBl基因突變,這可能為以后藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和神經(jīng)相關(guān)疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。因此,我們的研究成果不僅為內(nèi)耳和小腦發(fā)育的基礎(chǔ)研究填補(bǔ)了空白,并且在一定程度上推動了內(nèi)耳和小腦疾病臨床診斷治療的發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R3416
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本文編號：1838451