本文選題：脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞 + MYSM1　； 參考：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一類具有自我更新和多向分化能力的成體干細(xì)胞。近年來MSCs的另一個(gè)特性即免疫調(diào)節(jié)能力逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn),MSCs能抑制多種淋巴細(xì)胞的功能,在許多免疫相關(guān)疾病中被廣泛研究,但MSCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制仍然不是十分明確。組蛋白修飾中的泛素化和去泛素化是表觀遺傳學(xué)中一個(gè)重要的領(lǐng)域。MYSM1,一種組蛋白H2A去泛素化酶,能夠?qū)π∈篌w內(nèi)的多種免疫細(xì)胞發(fā)育和功能產(chǎn)生影響。那么,MYSM1是否會(huì)調(diào)控具有免疫調(diào)節(jié)能力的MSCs的功能,目前尚未有報(bào)道,但這卻為MSCs能否在臨床中廣泛應(yīng)用提供了 一個(gè)新的思路和依據(jù)。我們從以下三個(gè)部分進(jìn)行這方面的研究。第一部分:小鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定實(shí)驗(yàn)方法:首先利用基因型鑒定方法確定小鼠基因型,然后分離野生型(wild type, WT)小鼠和敲除型(knockout, KO)小鼠的腹股溝脂肪組織來源的MSCs (ADSCs),并對(duì)這兩種細(xì)胞的形態(tài)、增殖、表型和成脂成骨分化能力進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、Mysm1敲除并不影響ADSCs的形態(tài)、表型和增殖。WT和KOADSCs均陽(yáng)性表達(dá) Sca-1、CD44、CD29,陰性表達(dá) CD86、CD45、CD31、CD11b 及 MHCII 類分子;2、WT和KO ADSCs均具有成脂成骨分化能力。qRT-PCR結(jié)果顯示成骨相關(guān)基因Runx2、Osterix和Ocn以及成脂相關(guān)基因Ppar-γ、Cebp-α和aP2的表達(dá)量在各自的誘導(dǎo)下均升高。第二部分:MYSM1調(diào)控小鼠ADSCs免疫調(diào)節(jié)功能的體內(nèi)外研究實(shí)驗(yàn)方法:1、qRT-PCR檢測(cè)Mysm1在炎癥環(huán)境下的表達(dá)變化;2、通過兩種ADSCs與T細(xì)胞共培養(yǎng)來比較WT ADSCs和KO ADSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的影響;3、在炎癥環(huán)境下,檢測(cè)ADSCs表達(dá)免疫相關(guān)因子的mRNA水平以及細(xì)胞表面免疫表型的變化;4、建立IBD模型,檢測(cè)WT ADSCs和KO ADSCs在體內(nèi)免疫抑制能力的差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、Mysm 1在TNFα+IFNγ的刺激下表達(dá)最高,并且隨著其濃度及時(shí)間的增加而升高;2、WT和KO ADSCs均能抑制T細(xì)胞增殖,并且WT ADSCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制能力要明顯強(qiáng)于KO ADSCs;3、無(wú)論在有無(wú)TNFα+IFNy刺激下,WTADSCs均表達(dá)更高的抗炎因子iNOS、IL10,而KOADSCs則表達(dá)更高的炎癥因子IL1β、TNFα、IFNy及IL6; PD-L1的表達(dá)在低濃度刺激下均明顯升高且沒有差異,ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)也沒有差異;4、體內(nèi)IBD模型實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了 WT ADSCs具有更強(qiáng)的免疫抑制能力,更有助于小鼠炎癥的恢復(fù)。第三部分:MYSM1通過miR-150調(diào)控小鼠ADSCs免疫調(diào)節(jié)功能實(shí)驗(yàn)方法:1、qRT-PCR檢測(cè)WT和KO ADSCs中miR-150的表達(dá)差異;2、KO ADSCs過表達(dá)MYSM1后,檢測(cè)miR-150的表達(dá)變化;3、免疫染色質(zhì)共沉淀(CHIP)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MYSM1對(duì)miR-150的作用;4、C3H10T1/2過表達(dá)miR-150(C3H LV- miR-150),檢測(cè)其表型、增殖能力的變化;5、通過C3H LV- miR-150和C3H LV-GFP (對(duì)照細(xì)胞)與T細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),比較二者對(duì)抑制T細(xì)胞增殖能力的差異;6、qRT-PCR和流式技術(shù)檢測(cè)炎癥環(huán)境下C3H LV- miR-150和C3H LV-GFP免疫相關(guān)因子和細(xì)胞表面免疫表型的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、KOADSCs中miR-150的表達(dá)明顯低于WTADSCs;2、當(dāng)KOADSCs過表達(dá)MYSM1時(shí),miR-150的表達(dá)隨之升高;3、CHIP顯示MYSM1能結(jié)合到miR-150啟動(dòng)子上游1200-1000的區(qū)域;4、C3H LV- miR-150和C3H LV-GFP的表型沒有明顯變化,仍然顯示出干細(xì)胞表型;過表達(dá)miR-150相較于對(duì)照細(xì)胞C3H LV-GFP增殖能力變快;5、C3H10T1/2過表達(dá)miR-150后,其抑制T細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng);6、C3H10T1/2過表達(dá)miR-150后,促炎因子IFNγ及信號(hào)抑制分子SOCS1表達(dá)降低,抑炎因子iNOS和IL10表達(dá)升高;7、C3H10T1/2 過表達(dá) miR-150 后,PD-L1、VCAM-1、ICAM-1 表達(dá)沒有明顯差異。結(jié)論:MYSM1在ADSCs的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮重要的作用,敲除Mysm1后ADSCs的免疫抑制能力明顯減弱。MYSM1能夠作用于miR-150的啟動(dòng)子區(qū)促進(jìn)miR-150的表達(dá),從而對(duì)ADSCs的免疫調(diào)控功能發(fā)揮作用,但下游的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells (MSCs) are a kind of adult stem cells with self-renewal and multidirectional differentiation. In recent years, another characteristic of MSCs has been the focus of attention. MSCs can inhibit the function of many kinds of lymphocytes and is widely studied in many immune related diseases. However, the immunomodulatory mechanism of MSCs is still the mechanism of immunomodulating. Not very clear. Ubiquitination and ubiquitination in histone modification are an important field in epigenetics,.MYSM1, a histone H2A ubiquitinase, which can affect the development and function of various immune cells in mice. Then, whether MYSM1 will regulate the function of MSCs with immune regulation is not yet available. There are reports, but this provides a new idea and basis for the wide application of MSCs in clinical practice. We do this in the following three parts. The first part: the isolation, culture and identification of mouse fat derived mesenchymal stem cells: first of all, the gene type of mice was determined by the method of identification, and then divided into two parts. MSCs (ADSCs) from the inguinal adipose tissue derived from wild type (WT) mice and knockout (KO) mice and identification of the morphology, proliferation, phenotype and osteogenic differentiation of these two cells. Experimental results: 1, Mysm1 knockout does not affect the morphology of ADSCs, and the phenotype and proliferation of.WT and KOADSCs are both positive for Sca-1. D44, CD29, negative expression of CD86, CD45, CD31, CD11b and MHCII molecules; 2, WT and KO ADSCs all showed osteogenic differentiation ability.QRT-PCR results showed bone related genes Runx2. In vivo and in vitro research methods of regulating function: 1, qRT-PCR was used to detect the expression of Mysm1 in the inflammatory environment; 2, the effect of WT ADSCs and KO ADSCs on T cell proliferation was compared with two ADSCs and T cells; 3, in the inflammatory environment, the mRNA level of the immune related factors and the changes of the cell surface immunophenotype were detected by ADSCs; 4 The IBD model was established to detect the difference in the immune suppression ability of WT ADSCs and KO ADSCs in the body. The results were as follows: 1, Mysm 1 was expressed highest under the stimulation of TNF alpha +IFN gamma, and increased with the increase of concentration and time; 2, WT and KO ADSCs inhibited the proliferation of T cells. 3 Under the stimulation of TNF alpha +IFNy, WTADSCs expressed a higher anti-inflammatory factor iNOS, IL10, while KOADSCs expressed higher inflammatory factors IL1 beta, TNF a, IFNy and IL6, and PD-L1 expression increased obviously under low concentration and no difference, and there was no difference in ICAM-1 and expressions. 4 The third part: MYSM1 regulation of ADSCs immunoregulation in mice by miR-150: 1, qRT-PCR detection of the difference in miR-150 expression in WT and KO ADSCs; 2, KO ADSCs over expression MYSM1, detection of the changes in miR-150 expression; 3, immunochromatin coprecipitation test Verify the effect of MYSM1 on miR-150; 4, C3H10T1/2 overexpressed miR-150 (C3H LV- miR-150) to detect its phenotypic and proliferative ability. 5, the difference between the two groups was compared with that of C3H LV- miR-150 and C3H LV-GFP (control cells). C3H LV-GFP immune related factors and cell surface immunophenotype expression differences. Experimental results: 1, the expression of miR-150 in KOADSCs was significantly lower than WTADSCs; 2, when KOADSCs overexpressed MYSM1, the expression of miR-150 increased; 3, CHIP showed that MYSM1 could combine to the upstream region of the miR-150 promoter 1200-1000; 4 There was no obvious change in the phenotype and still showed the phenotype of stem cells; overexpression of miR-150 was faster than the control cell C3H LV-GFP proliferation ability; 5, C3H10T1/2 overexpressed miR-150, and the proliferation ability of T cells was significantly enhanced; and after C3H10T1/2 overexpressed miR-150, the expression of proinflammatory promoter and signal suppressor molecule SOCS1 expression decreased and anti inflammatory factor iNO was iNO. The expression of S and IL10 increased; 7, after C3H10T1/2 overexpression of miR-150, there was no significant difference in the expression of PD-L1, VCAM-1 and ICAM-1. Conclusion: MYSM1 plays an important role in the immune regulation of ADSCs, and the immunosuppressive ability of ADSCs after knocking down Mysm1 obviously decreases the expression of.MYSM1 to act on the promoter region. The immune regulatory function plays a role, but the specific mechanism of downstream needs further exploration.

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1802704