本文選題：β防御素 + 巨胞飲�。� 參考：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：第一部分基于防御素HBD2的巨胞飲介導(dǎo)融合蛋白的制備及其抗腫瘤活性和作用機(jī)制研究研究目的：據(jù)報(bào)道,K-Ras基因突變的胰腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的巨胞飲過程(elevated level of macropinocytosis),來滿足自身獨(dú)特的營養(yǎng)需求,這一發(fā)現(xiàn)為針對巨胞飲過程的靶向抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)方案提供了理論依據(jù)。本研究利用白蛋白作為巨胞飲介導(dǎo)的靶向治療藥物輸送載體,構(gòu)建了一種白蛋白整合的β防御素(DF-HSA),由“效應(yīng)”分子人β防御素2(HBD2, DF)和巨胞飲導(dǎo)向性的人血清白蛋白(HSA)兩部分組成,研究其對K-Ras突變胰腺癌的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：選擇胰腺癌MIA PaCa-2和BxPC-3細(xì)胞研究DF-HSA的巨胞飲攝取量和細(xì)胞毒性；并以HSA和HBD2分子作為實(shí)驗(yàn)對照,研究DF-HSA的體外抗腫瘤活性。建立人胰腺癌MIA PaCa-2裸鼠移植瘤模型進(jìn)行DF-HSA體內(nèi)靶向分布的考察和初步的藥效評價(jià)。應(yīng)用人類基因表達(dá)譜芯片檢測HBD2和DF-HSA作用于MIA PaCa-2細(xì)胞后的基因表達(dá)差異。研究結(jié)果：K-Ras突變的胰腺癌MIA PaCa-2細(xì)胞中,DF-HSA通過巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)化過程進(jìn)入細(xì)胞；MIA PaCa-2細(xì)胞中巨胞飲的強(qiáng)度與K-Ras野生型的BxPC-3細(xì)胞相比明顯增高；在細(xì)胞毒性方面,融合蛋白DF-HSA明顯強(qiáng)于HSA和游離的防御素HBD2; DF-HSA誘導(dǎo)MIA PaCa-2細(xì)胞線粒體損傷,并激活腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡途徑。值得注意的是,DF-HSA對K-Ras突變的MIA PaCa-2胰腺癌裸鼠移植瘤有顯著治療效果,30mg/kg的DF-HSA抑瘤率達(dá)到81%且耐受良好�；铙w呈像結(jié)果顯示,DF-HSA在體內(nèi)能特異性富集并長時(shí)間滯留在腫瘤部位。經(jīng)DF-HSA處理的MIA PaCa-2細(xì)胞基因表達(dá)譜變化明顯,這些基因功能涉及基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡等多個(gè)方面。結(jié)論：β防御素與白蛋白整合的融合蛋白DF-HSA,可以通過巨胞飲介導(dǎo)的過程大量進(jìn)入K-Ras突變的胰腺癌細(xì)胞,對胰腺癌裸鼠異種移植瘤顯示特異性分布,并有良好的治療效果。結(jié)果表明,DF-HSA在巨胞飲介導(dǎo)的腫瘤靶向治療方面是-個(gè)是有應(yīng)用前景的分子。第二部分基于防御素HBD1的雙單鏈抗體融合蛋白的制備HBD1作為人體先天性免疫的重要組成成分,不僅具有廣譜的抗微生物活性外,還具有殺傷腫瘤細(xì)胞和免疫調(diào)理的作用,而且不易產(chǎn)生耐藥性。大量的研究顯示,hbdl在體內(nèi)作為一種抑癌基因存在,而HBD1不僅可以選擇性地裂解殺傷腫瘤細(xì)胞,還能發(fā)揮抗腫瘤免疫的作用。所以HBD1具有良好的抗腫瘤潛能和應(yīng)用前景。由于涉及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和血管生成等過程,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)被認(rèn)為是一類理想的靶標(biāo)。明膠酶屬于基質(zhì)金屬蛋白酶的一種,包括MMP-2和MMP-9兩種組分,其能夠破壞基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的完整性,參與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移,并且在腫瘤血管發(fā)生和新生血管的形成過程中都起到重要作用。據(jù)報(bào)道,明膠酶在侵襲和轉(zhuǎn)移性腫瘤如在胰腺癌中大量表達(dá)。本研究的目的是選擇人β防御素1 (HBD1)作為抗腫瘤活性分子,通過基因工程手段構(gòu)建了以LDP為支架具有靶向明膠酶(MMP2/9)的防御素HBD1融合蛋白β1-dFv-LDP,利用抗體靶向結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面及微環(huán)境MMP2/9的特性,將HBD1定向運(yùn)輸至腫瘤部位,使其發(fā)揮特異性腫瘤細(xì)胞毒作用和抗腫瘤免疫作用,同時(shí)抑制MMP2/9的表達(dá)或者活性,為胰腺癌靶向治療藥物的研究提供借鑒與參考。本研究中我們通過分子生物學(xué)方法構(gòu)建了重組表達(dá)載體PET-30a/β1-dFv-LDP,通過大腸桿菌表達(dá)體系誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在,經(jīng)純化復(fù)性后每升發(fā)酵液可以獲得20mgβ1-dFv-LDP融合蛋白,該融合蛋白對明膠酶抗原具有與dFv-LDP相似的的親和活性。第三部分靶向EGFR/明膠酶的雙特異性單鏈抗體融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv(M)的制備多靶向治療策略一直是抗腫瘤研究中最熱門的話題之一。其中雙特異性抗體能同時(shí)高效結(jié)合兩種抗原表位,是多重調(diào)控功能的聯(lián)合靶向抗腫瘤的有效策略之一。表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor, EGFR)屬于跨膜受體酪氨酸激酶(ErbB)家族成員；EGFR在多種腫瘤細(xì)胞表面都異常表達(dá),與人類癌癥關(guān)系密切,被認(rèn)為是研究腫瘤治療的一個(gè)重要分子靶點(diǎn)。此外,腫瘤基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)也在腫瘤進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用,其中明膠酶(MMP-2和MMP-9)在多種腫瘤組織中異常表達(dá),使其成為另一個(gè)理想的靶向治療靶點(diǎn)。力達(dá)霉素(Lidamycin, LDM)是一種具有高效抗腫瘤活性的大分子肽類抗腫瘤抗生素,由輔基蛋白(LDP)和烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(AE)兩部分組成,發(fā)色團(tuán)是力達(dá)霉素分子的活性部分。基于EGFR和MMP2/9在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用,本研究的目的是制備一種同時(shí)靶向EGFR和明膠酶的并具有藥物導(dǎo)向的雙特異性單鏈抗體融合蛋白Fv(E)-LDP-Fv(M),該融合蛋白由三部分組成：兩個(gè)分別靶向EGFR和MMP2/9的scFv作為導(dǎo)向分子,力達(dá)霉素作為“彈頭”藥物,并對其體內(nèi)外抗腫瘤活性進(jìn)行檢測。表達(dá)該重組蛋白的質(zhì)粒pET30a(+)/Fv(E)-LDP-Fv(M)經(jīng)過序列測定后,轉(zhuǎn)化于大腸桿菌Transetta(DE3)中,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在,目的蛋白經(jīng)純化、復(fù)性后,每升發(fā)酵液可以獲得0.5 mg有活性的Fv(E)-LDP-Fv(M)融合蛋白,該融合蛋白對EGFR和明膠酶抗原均有較好的親和活性。
[Abstract]:The first part is to study the anti - tumor activity of human pancreatic cancer cells with K - Ras gene mutation , and to study its anti - tumor activity against K - Ras mutant pancreatic cancer .
In vitro anti - tumor activity of DF - HSA was investigated by using HSA and HBD2 molecules as experimental controls . The gene expression of DF - HSA in human pancreatic cancer MIA PaCa - 2 nude mice was investigated .
The intensity of giant cell in MIA PaCa - 2 cells was significantly higher than that of wild type BxPC - 3 cells of wild type K - Ras .
The results showed that the fusion protein DF - HSA induced by DF - HSA could be used as an important component of human innate immunity , and it could not only selectively lyse killer tumor cells but also play an important role in the formation of tumor cells . epidermal growth factor receptor ( EGFR ) is a member of transmembrane receptor tyrosine kinase ( erbB ) family ;
The expression of EGFR and MMP - 9 in various tumor tissues plays an important role in tumor progression and invasion and metastasis .

【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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