本文選題：LTB + LTB突變型　； 參考：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞基(LTB)是一種很好的粘膜免疫佐劑,已有研究發(fā)現(xiàn),LTB可以與細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)結(jié)合[1],進(jìn)而發(fā)揮佐劑效應(yīng),除此之外,其他相關(guān)信號(hào)通路作用機(jī)制仍未有明確的報(bào)道,一直是推動(dòng)進(jìn)一步研究的瓶頸,因此,到目前為止粘膜免疫佐劑仍未被應(yīng)運(yùn)到臨床中。本研究在野生型LTB的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了4種T細(xì)胞和B細(xì)胞表位突變型,研究比較找出具有佐劑活性的突變型,進(jìn)而為L(zhǎng)TB詳細(xì)作用機(jī)制的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。目的:野生型LTB及其突變型的佐劑活性比較研究,初步評(píng)價(jià)LTB突變對(duì)其粘膜免疫佐劑活性的影響,找出佐劑增效相對(duì)較強(qiáng)的突變型,分析野生型LTB及其突變型的作用機(jī)制。方法:本研究利用高保真DNA聚合酶通過(guò)PCR的方法對(duì)LTB進(jìn)行定位突變,構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET32a-LTB26、p ET32a-LTB34、p ET32a-LTB57和p ET32a-LTB85,通過(guò)菌液PCR檢測(cè)、質(zhì)粒酶切檢測(cè)以及測(cè)序驗(yàn)證,鑒定突變型的正確性,確定突變型蛋白表達(dá)的最適條件,誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)野生型LTB及4種突變型蛋白大小,采用His標(biāo)簽純化蛋白,TGE透析復(fù)性,PEG8000對(duì)蛋白進(jìn)行濃縮,得到高純度的LTB、LTB26、LTB34、LTB57和LTB85蛋白,去除蛋白內(nèi)毒素,分別聯(lián)合VP8免疫Balb/c雌性小鼠(免疫期間小鼠生命體征正常),收集小鼠的血清和肺洗液,采用間接ELISA法檢測(cè)血清和肺洗液中的Ig G和s Ig A水平。以Anti-NLRP3、Anti-AKT1、Anti-MAP2K3和Anti-MAP2K4為一抗,通過(guò)免疫組化法檢測(cè)免疫小鼠鼻粘膜組織和脾臟組織中NLRP3、AKT1、MAP2K3和MAP2K4受體的表達(dá)量。結(jié)果:1.成功構(gòu)建p ET32a-LTB26、p ET32a-LTB34、p ET32a-LTB57和p ET32a-LTB85突變型重組質(zhì)粒。2.在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)了帶His標(biāo)簽的LTB26、LTB34、LTB57和LTB85融合蛋白。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明突變型LTB26和LTB34聯(lián)合VP8免疫小鼠的血清和肺洗液中的特異性Ig G和s Ig A抗體水平明顯高于LTB聯(lián)合VP8組,初步篩選出了兩種佐劑活性進(jìn)一步提高的突變型LTB26和LTB34。3.免疫組化結(jié)果顯示:NLRP3在鼻粘膜LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)量均低于VP8對(duì)照組,相似地,NLRP3在脾臟組織LTB+VP8和LTB26+VP8佐劑組中的表達(dá)也表現(xiàn)出了類似的趨勢(shì);AKT1在鼻粘膜LTB26+VP8佐劑組中表達(dá)高于VP8對(duì)照組,其余各組均低于VP8組,而AKT1在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)均明顯高于VP8組(p0.05);MAP2K3在鼻粘膜LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)均低于VP8組和LTB57+VP8組(無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異),而MAP2K3在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的表達(dá)量均高于VP8和LTB57+VP8對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);MAP2K4在鼻粘膜LTB+VP8和LTB26+VP8組的表達(dá)均稍高于VP8組,而MAP2K4在脾臟組織LTB+VP8、LTB26+VP8和LTB34+VP8佐劑組中的均明顯高于VP8組和LTB57+VP8組。結(jié)論:1.成功表達(dá)了帶His標(biāo)簽的LTB26、LTB34、LTB57和LTB85融合蛋白;2.篩選出了佐劑活性進(jìn)一步增強(qiáng)的突變型LTB26和LTB34;3.初步推測(cè)NLRP3與LTB及LTB26的佐劑增效機(jī)制無(wú)關(guān);AKT1可能與LTB26突變型的佐劑增效機(jī)制呈正相關(guān);MAP2K4與LTB和LTB26佐劑活性呈正相關(guān)性;MAP2K3在脾臟組織中與LTB及其突變體的佐劑活性呈負(fù)相關(guān)性,而在粘膜組織中與LTB及其突變體的佐劑活性呈正相關(guān)性,這種在不同免疫組織中的異質(zhì)性以及不同突變體在同一免疫組織中的差異性為進(jìn)一步了解LTB及其突變體的佐劑機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this study , we used high fidelity DNA polymerase to detect wild type LTB ( LTB ) and mutant protein ( LTB26 ) , and then to find out the optimal conditions for the expression of LTB , LTB26 , LTB34 , LTB57 and LTB85 . Results : 1 . The expression of LTB26 , LTB34 , LTB57 and LTB85 fusion protein in LTB26 + VP8 , LTB26 + VP8 and LTB34 + VP8 adjuvant group were significantly higher than that of VP8 group .

【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1754737