本文選題：靶向治療 + CD19��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：據(jù)報(bào)道,我國(guó)每年新發(fā)生的小兒惡性腫瘤達(dá)3萬(wàn)例,其中1/3為白血病。特別是急性白血病已成為威脅兒童生命健康的第一位惡性腫瘤。隨著診療水平的提高及治療方案改進(jìn),目前中國(guó)兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)完全緩解(CR)率已達(dá)95%以上,5年生存率已提高到80%以上¨。但白血病耐藥和復(fù)發(fā)情況仍是目前影響白血病患者預(yù)后的重要原因。從分子和基因水平尋找新的作用靶點(diǎn),在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)特異的靶向藥物,這將為ALL的個(gè)體化治療提供獨(dú)特手段。腫瘤靶向治療是定向?qū)Π屑?xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。通過(guò)與靶細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)志結(jié)合而直接作用于靶細(xì)胞,從而不影響正常組織細(xì)胞的功能。其中以抗體的靶向治療研究得最為深入。CD19是繼CD20之后B細(xì)胞惡性腫瘤免疫治療引人矚目的另一個(gè)分子靶點(diǎn),因?yàn)樗辉谡；驉盒訠淋巴細(xì)胞表面表達(dá),幾乎不在其他組織表達(dá)；且在B細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中不丟失。其特異性和穩(wěn)定性使其作為一個(gè)理想的靶點(diǎn)受人關(guān)注。我院自主研制的ZCH-4-2E8(抗人CD19)抗體為鼠源的IgM抗體,前期研究顯示其可靶向B系白血病細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室在親本2E8抗體的基礎(chǔ)上已成功構(gòu)建人鼠嵌合單鏈抗體scFv2E8-Fc。功能試驗(yàn)顯示,改造后的scFv2E8-Fc抗體與親本2E8抗體相比,與抗原結(jié)合的親和力明顯降低。國(guó)外研究表明,抗體多價(jià)化后由于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的增多和分子量的增大,其親和力較單價(jià)抗體會(huì)有明顯提高。因此,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)基因工程技術(shù)構(gòu)建抗人CD19的二價(jià)及四價(jià)抗體,并進(jìn)行后續(xù)的體外及體內(nèi)功能試驗(yàn)研究。本研究主要由以下幾個(gè)部分組成：1、構(gòu)建抗人CD19的二價(jià)及四價(jià)抗體真核表達(dá)載體。2、二價(jià)及四價(jià)多聚體蛋白在真核細(xì)胞中華倉(cāng)鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)細(xì)胞中的表達(dá)及體外功能研究。3、建立血液系統(tǒng)惡性腫瘤動(dòng)物模型,檢測(cè)多價(jià)抗體的體內(nèi)治療作用。方法：1單鏈抗體scFv2E8及其雙價(jià)抗體diascFv2E8真核表達(dá)載體的構(gòu)建1.1單鏈抗體pcDNA3.1/scFv2E8真核表達(dá)載體的構(gòu)建以能夠持續(xù)分泌scFv2E8-Fc融合蛋白并已成功建株的pcDNA3.1-scFv2E8-FcCHO細(xì)胞作為目的細(xì)胞,采用RT-PCR法釣取細(xì)胞中scFv2E8目的基因,克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒中,構(gòu)建單鏈抗體pcDNA3.1/scFv2E8真核表達(dá)載體。1.2 pcDNA3.1/Fc-6×his真核表達(dá)載體的構(gòu)建以本實(shí)驗(yàn)室前期已成功構(gòu)建的pcDNA3.1/Fc質(zhì)粒為模板,針對(duì)Fc基因片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR,通過(guò)引物在Fc段下游引入6xhis標(biāo)簽,并在基因序列的5’和3’端分別引入EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)。構(gòu)建中間載體pcDNA3.1/Fc-6xhis.1.3雙價(jià)抗體pcDNA3.1/diascFv2E8真核表達(dá)載體的構(gòu)建以pcDNA3.1/scFv2E8質(zhì)粒作為模板,設(shè)計(jì)引物,通過(guò)SOE-PCR的方法擴(kuò)增"VH2E8-linker5-VL2E8"目的基因片段,將VH2E8與VL2Es之間的連接肽(linker)縮短為五個(gè)氨基酸的G4S,并且在VL2E8基因的末端引入6xhis標(biāo)簽和終止子TAG,并將其克隆至pcDNA3.1載體,構(gòu)建雙價(jià)抗體真核表達(dá)載體pcDNA3.1/diascFv2E8.2 pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53兩種四價(jià)多聚體真核表達(dá)載體的構(gòu)建2.1 四價(jià)抗體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc真核表達(dá)載體的構(gòu)建將二價(jià)抗體真核表達(dá)載體pcDNA3.1/diascFv2E8相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間的基因片段VH2E8-linker5-VL2E8平行克隆至中間載體pcDNA3.1/Fc-6xhis上,通過(guò)兩個(gè)Fc段之間的二硫鍵的偶聯(lián),構(gòu)建四價(jià)抗體的真核表達(dá)載體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc.2.2四價(jià)抗體Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表達(dá)載體的構(gòu)建以pcDNA3.1/scFv2E8質(zhì)粒為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增scFv2E8基因片段,并在其兩端引入Hind Ⅲ和BamH I酶切位點(diǎn)。全基因合成P53-hinge-hisx6片段,通過(guò)一段連接肽(人IgG3上游鉸鏈區(qū))將其與單鏈scFv2E8基因片段相連。通過(guò)P53四聚化結(jié)構(gòu)域指導(dǎo)scFv2E8蛋白自動(dòng)組裝為四聚體,構(gòu)建四價(jià)抗體真核表達(dá)載體Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53.3二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白的表達(dá)和功能測(cè)定3.1二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白的真核細(xì)胞表達(dá)抽提轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒pcDNA3.1/diascFv2E8、pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53,轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞CHO。轉(zhuǎn)染后G418持續(xù)加壓篩選,流式細(xì)胞術(shù)鑒定各轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中是否存在有活性的二價(jià)及四價(jià)重組蛋白。通過(guò)有限稀釋法亞克隆相應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞株,收集其上清中的蛋白。通過(guò)Millipore超濾管20：1超濾濃縮收集上清,Ni-IDA親和層析法純化帶有6xhis標(biāo)簽的重組蛋白。改良Marshall法制備2E8-FITC直標(biāo)抗體。3.2二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53多聚體蛋白的功能研究利用上述濃縮純化的二價(jià)及四價(jià)重組蛋白進(jìn)行如下功能研究：BCA法測(cè)定重組蛋白的濃度；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的滴定實(shí)驗(yàn)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53對(duì)2E8-FITC直標(biāo)抗體的阻滯作用；RT-PCR檢測(cè)CHO/diascFv2E8、 CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53細(xì)胞中的目的基因的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光法鑒定重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53;競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)鑒定四種抗體scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的相對(duì)親和力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)四種抗體scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的內(nèi)化特性；四種抗體scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的解離率實(shí)驗(yàn)；scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53抗體誘導(dǎo)的凋亡作用；比較人鼠嵌合抗體scFv2E8-Fc和四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的.ADCC、CDC作用；SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中重組蛋白的表達(dá)。4多價(jià)抗體的血液系統(tǒng)腫瘤動(dòng)物模型體內(nèi)治療作用研究通過(guò)對(duì)重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)的尾靜脈注射Raji細(xì)胞,建立伯基特淋巴瘤動(dòng)物模型。小鼠隨機(jī)分組進(jìn)行治療,共分為6組：PBS空白對(duì)照組、造模組、scFv2E8抗體治療組、diascFv2E8抗體治療組、diascFv2E8-Fc抗體治療組和scFv2E8-P53抗體治療組。上述各抗體治療組分別于Raji細(xì)胞注射一周后,通過(guò)尾靜脈注射各純化的抗體50μg/只,連續(xù)3天。密切觀察小鼠的狀況,定期測(cè)量小鼠體重,以后肢癱瘓為發(fā)病標(biāo)準(zhǔn)。記錄發(fā)病及死亡日期,繪制生存曲線。頸椎脫臼法處死瀕死小鼠,取各臟器做石蠟包埋切片,行HE染色和免疫組化檢查。結(jié)果：1單鏈抗體scFv2E8及其雙價(jià)抗體diascFv2E8真核表達(dá)載體成功構(gòu)建1.1單鏈抗體pcDNA3.1/scFv2E8真核表達(dá)載體成功構(gòu)建以pcDNA3.1-scFv2E8-Fc CHO細(xì)胞作為模板,RT-PCR成功擴(kuò)增scFv2E8目的基因,切膠回收目的基因產(chǎn)物TA克隆至pGEM(?)-T easy載體,將pGEM-T/scFv2E8載體上的目的基因片段采用EcoR I和BamH I雙酶切平行克隆至pcDNA3.1載體,測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1/scFv2E8質(zhì)粒構(gòu)建成功。1.2 pcDNA3.1/Fc-6xhis真核表達(dá)載體成功構(gòu)建通過(guò)PCR成功擴(kuò)增目的基因片段Fc-6xhis,切膠純化回收后TA克隆至pGEM(?)-T easy載體,將pGEM-T/Fc-6×his載體上的目的基因片段采用EcoR I和Xba I雙酶切平行克隆至pcDNA3.1載體,測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1/Fc-6×his中間載體構(gòu)建成功。1.3雙價(jià)抗體pcDNA3.1/diascFv2E8真核表達(dá)載體成功構(gòu)建SOE-PCR成功擴(kuò)增目的基因片段VH2E8-linker5-VL2E8 (810bp),切膠回收目的基因產(chǎn)物TA克隆至pGEM(?)-T easy載體,將pGEM-T/VH2E8-linker5-VL2E8載體上的目的基因片段采用BamH I和EcoR I雙酶切平行克隆至pcDNA3.1載體,測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1/diascFv2E8載體構(gòu)建成功。2 pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53兩種四價(jià)抗體真核表達(dá)載體成功構(gòu)建2.1 四價(jià)抗體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc真核表達(dá)載體成功構(gòu)建分別用BamHI和EcoR I對(duì)pcDNA3.1/diascFv2E8和pcDNA3.1/Fc-6xhis質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,切膠回收目的基因片段diascFv2E8和載體pcDNA3.1/Fc-6xhis,兩者按3：1摩爾比成功連接,測(cè)序證實(shí)pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2四價(jià)抗體Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表達(dá)載體成功構(gòu)建PCR成功擴(kuò)增scFv2E8基因片段,切膠回收目的基因產(chǎn)物TA克隆至pGEM(?)-T easy載體。全基因合成P53-hinge-his×6基因片段(213bp),成功構(gòu)建pcDNA3.1/P53-hinge-his×6質(zhì)粒。將pGEM-T/Hind III-scFv2E8-BamH I載體上的單鏈scFv2E8基因平行克隆至pcDNA3.1/P53-hinge-hisx6載體。測(cè)序證實(shí)Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53質(zhì)粒構(gòu)建成功。3二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白的成功表達(dá)及功能測(cè)定3.1 二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白在真核細(xì)胞CHO中成功表達(dá)pcDNA3.1/diascFv2E8, pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53轉(zhuǎn)染級(jí)質(zhì)粒抽提成功。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后,以6418 600μg/ml加壓穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHO/diascFv2E8、CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53的培養(yǎng)上清中均存在有活性的能識(shí)別Raji細(xì)胞上CD19抗原的重組多聚體蛋白。經(jīng)過(guò)3次亞克隆后,轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHO/diascFv2E8、CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53均已成功建株。收集上清中相應(yīng)蛋白并已濃縮純化。改良Marshall法成功制備2E8-FITC直標(biāo)抗體。3.2二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53多聚體蛋白的功能研究BCA法測(cè)重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc 和 scFv2E8-P53濃度分別為0.210mg/ml、0.231mg/ml和0.177mg/ml;滴定實(shí)驗(yàn)顯示,飽和lx106Raji細(xì)胞分別需要diascFv2E8、diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53和2E8-FITC抗體的量為2.1μg、 1.5μg、2.0μg和1.5μg；阻滯實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),多價(jià)抗體對(duì)親本2E8的阻滯作用均優(yōu)于單價(jià)抗體,且四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc效果最佳；RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)各目的基因已成功轉(zhuǎn)染至CHO真核細(xì)胞；細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞CHO/diascFv2E8、 CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53胞漿內(nèi)均可見(jiàn)清晰的綠色熒光,說(shuō)明上述三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞均已成功表達(dá)融合蛋白；通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)計(jì)算scFv2E8、 diascFv2E8、scFv2E8-P53和diascFv2E8-Fc蛋白的相對(duì)親和力常數(shù)為：1×1010M-1、 4×1010M-1、1.6×1011M-1和4×1011M-1；內(nèi)化實(shí)驗(yàn)顯示,二價(jià)抗體diascFv2E8較單價(jià)抗體scFv2E8內(nèi)化快。但兩種四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53蛋白內(nèi)化率與單價(jià)scFv2E8相比沒(méi)有明顯差異；解離率實(shí)驗(yàn)顯示四價(jià)抗體的解離速率明顯低于雙價(jià)及單價(jià)抗體；凋亡實(shí)驗(yàn)顯示：四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc誘導(dǎo)的凋亡作用最強(qiáng),優(yōu)于二價(jià)抗體diascFv2E8,單價(jià)scFv2E8抗體幾乎沒(méi)有促凋亡的作用；四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的ADCC作用強(qiáng)于scFv2E8-Fc抗體；在抗體高濃度時(shí)(50μg/ml, 25μg/ml),四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的CDC作用強(qiáng)于scFv2E8-Fc抗體；SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果顯示,diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53蛋白產(chǎn)物均以混合體的形式存在。4多價(jià)抗體的血液系統(tǒng)腫瘤動(dòng)物模型體內(nèi)治療作用研究伯基特淋巴瘤動(dòng)物模型建立成功；發(fā)病小鼠出現(xiàn)體重下降,后肢癱瘓,并伴有脊柱側(cè)彎、弓背、呈惡病質(zhì)；HE染色和免疫組化(抗人CD19抗體標(biāo)記)檢測(cè)結(jié)果顯示,發(fā)病小鼠腦膜均有腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn),免疫組化染色可見(jiàn)褐黃色腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)腦膜；生存分析顯示,各組間的生存時(shí)間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。四價(jià)抗體在體內(nèi)治療作用優(yōu)于二價(jià)及單價(jià)抗體,尤以四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的體內(nèi)治療效果最好。結(jié)論：1、二價(jià)抗體pcDNA3.1/diascFv2E8及兩種四價(jià)抗體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。2、二價(jià)diascFv2E8和四價(jià)diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白在真核細(xì)胞CHO中成功表達(dá)。這些多價(jià)抗體都能夠識(shí)別表達(dá)CD19抗原分子的Raji細(xì)胞。3、體外功能試驗(yàn)顯示：四價(jià)抗體的親和力顯著優(yōu)于二價(jià)及單價(jià)抗體,尤以四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的親和力最強(qiáng)；四價(jià)抗體的解離速率明顯低于雙價(jià)及單價(jià)抗體,半衰期延長(zhǎng),可以在體內(nèi)更好地發(fā)揮作用；多價(jià)抗體能引起明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的ADCC和CDC作用強(qiáng)于人鼠嵌合單鏈抗體scFv2E8-Fc,提示多價(jià)抗體可以通過(guò)CDC、ADCC作用和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡更好地靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。4、伯基特淋巴瘤動(dòng)物模型建立成功；體內(nèi)功能試驗(yàn)顯示,四價(jià)抗體在小鼠體內(nèi)治療作用優(yōu)于二價(jià)及單價(jià)抗體,尤以四價(jià)抗體diascFv2E8-Fc的體內(nèi)治療效果最好。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊衛(wèi)東;用基因工程技術(shù)制備多價(jià)微型抗體的研究[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊(cè));1999年02期

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本文編號(hào)：1737518