本文選題：靶向治療 + CD19��； 參考：《浙江大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景及目的：據(jù)報道,我國每年新發(fā)生的小兒惡性腫瘤達3萬例,其中1/3為白血病。特別是急性白血病已成為威脅兒童生命健康的第一位惡性腫瘤。隨著診療水平的提高及治療方案改進,目前中國兒童急性淋巴細胞白血病(ALL)完全緩解(CR)率已達95%以上,5年生存率已提高到80%以上¨。但白血病耐藥和復(fù)發(fā)情況仍是目前影響白血病患者預(yù)后的重要原因。從分子和基因水平尋找新的作用靶點,在此基礎(chǔ)上設(shè)計特異的靶向藥物,這將為ALL的個體化治療提供獨特手段。腫瘤靶向治療是定向?qū)Π屑毎M行特異性殺傷。通過與靶細胞表面特異性分子標志結(jié)合而直接作用于靶細胞,從而不影響正常組織細胞的功能。其中以抗體的靶向治療研究得最為深入。CD19是繼CD20之后B細胞惡性腫瘤免疫治療引人矚目的另一個分子靶點,因為它只在正�；驉盒訠淋巴細胞表面表達,幾乎不在其他組織表達；且在B細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中不丟失。其特異性和穩(wěn)定性使其作為一個理想的靶點受人關(guān)注。我院自主研制的ZCH-4-2E8(抗人CD19)抗體為鼠源的IgM抗體,前期研究顯示其可靶向B系白血病細胞。本實驗室在親本2E8抗體的基礎(chǔ)上已成功構(gòu)建人鼠嵌合單鏈抗體scFv2E8-Fc。功能試驗顯示,改造后的scFv2E8-Fc抗體與親本2E8抗體相比,與抗原結(jié)合的親和力明顯降低。國外研究表明,抗體多價化后由于其抗原結(jié)合位點的增多和分子量的增大,其親和力較單價抗體會有明顯提高。因此,本研究在前期研究的基礎(chǔ)上,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建抗人CD19的二價及四價抗體,并進行后續(xù)的體外及體內(nèi)功能試驗研究。本研究主要由以下幾個部分組成：1、構(gòu)建抗人CD19的二價及四價抗體真核表達載體。2、二價及四價多聚體蛋白在真核細胞中華倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)細胞中的表達及體外功能研究。3、建立血液系統(tǒng)惡性腫瘤動物模型,檢測多價抗體的體內(nèi)治療作用。方法：1單鏈抗體scFv2E8及其雙價抗體diascFv2E8真核表達載體的構(gòu)建1.1單鏈抗體pcDNA3.1/scFv2E8真核表達載體的構(gòu)建以能夠持續(xù)分泌scFv2E8-Fc融合蛋白并已成功建株的pcDNA3.1-scFv2E8-FcCHO細胞作為目的細胞,采用RT-PCR法釣取細胞中scFv2E8目的基因,克隆至pcDNA3.1質(zhì)粒中,構(gòu)建單鏈抗體pcDNA3.1/scFv2E8真核表達載體。1.2 pcDNA3.1/Fc-6×his真核表達載體的構(gòu)建以本實驗室前期已成功構(gòu)建的pcDNA3.1/Fc質(zhì)粒為模板,針對Fc基因片段設(shè)計引物進行PCR,通過引物在Fc段下游引入6xhis標簽,并在基因序列的5’和3’端分別引入EcoR I和Xba I酶切位點。構(gòu)建中間載體pcDNA3.1/Fc-6xhis.1.3雙價抗體pcDNA3.1/diascFv2E8真核表達載體的構(gòu)建以pcDNA3.1/scFv2E8質(zhì)粒作為模板,設(shè)計引物,通過SOE-PCR的方法擴增"VH2E8-linker5-VL2E8"目的基因片段,將VH2E8與VL2Es之間的連接肽(linker)縮短為五個氨基酸的G4S,并且在VL2E8基因的末端引入6xhis標簽和終止子TAG,并將其克隆至pcDNA3.1載體,構(gòu)建雙價抗體真核表達載體pcDNA3.1/diascFv2E8.2 pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53兩種四價多聚體真核表達載體的構(gòu)建2.1 四價抗體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc真核表達載體的構(gòu)建將二價抗體真核表達載體pcDNA3.1/diascFv2E8相應(yīng)酶切位點之間的基因片段VH2E8-linker5-VL2E8平行克隆至中間載體pcDNA3.1/Fc-6xhis上,通過兩個Fc段之間的二硫鍵的偶聯(lián),構(gòu)建四價抗體的真核表達載體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc.2.2四價抗體Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表達載體的構(gòu)建以pcDNA3.1/scFv2E8質(zhì)粒為模板,設(shè)計引物擴增scFv2E8基因片段,并在其兩端引入Hind Ⅲ和BamH I酶切位點。全基因合成P53-hinge-hisx6片段,通過一段連接肽(人IgG3上游鉸鏈區(qū))將其與單鏈scFv2E8基因片段相連。通過P53四聚化結(jié)構(gòu)域指導(dǎo)scFv2E8蛋白自動組裝為四聚體,構(gòu)建四價抗體真核表達載體Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53.3二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白的表達和功能測定3.1二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白的真核細胞表達抽提轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒pcDNA3.1/diascFv2E8、pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53,轉(zhuǎn)染真核細胞CHO。轉(zhuǎn)染后G418持續(xù)加壓篩選,流式細胞術(shù)鑒定各轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)上清中是否存在有活性的二價及四價重組蛋白。通過有限稀釋法亞克隆相應(yīng)陽性細胞株,收集其上清中的蛋白。通過Millipore超濾管20：1超濾濃縮收集上清,Ni-IDA親和層析法純化帶有6xhis標簽的重組蛋白。改良Marshall法制備2E8-FITC直標抗體。3.2二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53多聚體蛋白的功能研究利用上述濃縮純化的二價及四價重組蛋白進行如下功能研究：BCA法測定重組蛋白的濃度；流式細胞術(shù)檢測三種重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的滴定實驗；流式細胞術(shù)檢測三種重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53對2E8-FITC直標抗體的阻滯作用；RT-PCR檢測CHO/diascFv2E8、 CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53細胞中的目的基因的表達；細胞免疫熒光法鑒定重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53;競爭性結(jié)合實驗鑒定四種抗體scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的相對親和力；流式細胞術(shù)檢測四種抗體scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的內(nèi)化特性；四種抗體scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53的解離率實驗；scFv2E8、diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53抗體誘導(dǎo)的凋亡作用；比較人鼠嵌合抗體scFv2E8-Fc和四價抗體diascFv2E8-Fc的.ADCC、CDC作用；SDS-PAGE和Western-Blot檢測細胞培養(yǎng)上清中重組蛋白的表達。4多價抗體的血液系統(tǒng)腫瘤動物模型體內(nèi)治療作用研究通過對重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID小鼠)的尾靜脈注射Raji細胞,建立伯基特淋巴瘤動物模型。小鼠隨機分組進行治療,共分為6組：PBS空白對照組、造模組、scFv2E8抗體治療組、diascFv2E8抗體治療組、diascFv2E8-Fc抗體治療組和scFv2E8-P53抗體治療組。上述各抗體治療組分別于Raji細胞注射一周后,通過尾靜脈注射各純化的抗體50μg/只,連續(xù)3天。密切觀察小鼠的狀況,定期測量小鼠體重,以后肢癱瘓為發(fā)病標準。記錄發(fā)病及死亡日期,繪制生存曲線。頸椎脫臼法處死瀕死小鼠,取各臟器做石蠟包埋切片,行HE染色和免疫組化檢查。結(jié)果：1單鏈抗體scFv2E8及其雙價抗體diascFv2E8真核表達載體成功構(gòu)建1.1單鏈抗體pcDNA3.1/scFv2E8真核表達載體成功構(gòu)建以pcDNA3.1-scFv2E8-Fc CHO細胞作為模板,RT-PCR成功擴增scFv2E8目的基因,切膠回收目的基因產(chǎn)物TA克隆至pGEM(?)-T easy載體,將pGEM-T/scFv2E8載體上的目的基因片段采用EcoR I和BamH I雙酶切平行克隆至pcDNA3.1載體,測序證實pcDNA3.1/scFv2E8質(zhì)粒構(gòu)建成功。1.2 pcDNA3.1/Fc-6xhis真核表達載體成功構(gòu)建通過PCR成功擴增目的基因片段Fc-6xhis,切膠純化回收后TA克隆至pGEM(?)-T easy載體,將pGEM-T/Fc-6×his載體上的目的基因片段采用EcoR I和Xba I雙酶切平行克隆至pcDNA3.1載體,測序證實pcDNA3.1/Fc-6×his中間載體構(gòu)建成功。1.3雙價抗體pcDNA3.1/diascFv2E8真核表達載體成功構(gòu)建SOE-PCR成功擴增目的基因片段VH2E8-linker5-VL2E8 (810bp),切膠回收目的基因產(chǎn)物TA克隆至pGEM(?)-T easy載體,將pGEM-T/VH2E8-linker5-VL2E8載體上的目的基因片段采用BamH I和EcoR I雙酶切平行克隆至pcDNA3.1載體,測序證實pcDNA3.1/diascFv2E8載體構(gòu)建成功。2 pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53兩種四價抗體真核表達載體成功構(gòu)建2.1 四價抗體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc真核表達載體成功構(gòu)建分別用BamHI和EcoR I對pcDNA3.1/diascFv2E8和pcDNA3.1/Fc-6xhis質(zhì)粒進行雙酶切,切膠回收目的基因片段diascFv2E8和載體pcDNA3.1/Fc-6xhis,兩者按3：1摩爾比成功連接,測序證實pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2四價抗體Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表達載體成功構(gòu)建PCR成功擴增scFv2E8基因片段,切膠回收目的基因產(chǎn)物TA克隆至pGEM(?)-T easy載體。全基因合成P53-hinge-his×6基因片段(213bp),成功構(gòu)建pcDNA3.1/P53-hinge-his×6質(zhì)粒。將pGEM-T/Hind III-scFv2E8-BamH I載體上的單鏈scFv2E8基因平行克隆至pcDNA3.1/P53-hinge-hisx6載體。測序證實Miniantibody pcDNA3.1/scFv2E8-P53質(zhì)粒構(gòu)建成功。3二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白的成功表達及功能測定3.1 二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白在真核細胞CHO中成功表達pcDNA3.1/diascFv2E8, pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒抽提成功。上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞后,以6418 600μg/ml加壓穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。流式檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞CHO/diascFv2E8、CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53的培養(yǎng)上清中均存在有活性的能識別Raji細胞上CD19抗原的重組多聚體蛋白。經(jīng)過3次亞克隆后,轉(zhuǎn)染細胞CHO/diascFv2E8、CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53均已成功建株。收集上清中相應(yīng)蛋白并已濃縮純化。改良Marshall法成功制備2E8-FITC直標抗體。3.2二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53多聚體蛋白的功能研究BCA法測重組蛋白diascFv2E8、diascFv2E8-Fc 和 scFv2E8-P53濃度分別為0.210mg/ml、0.231mg/ml和0.177mg/ml;滴定實驗顯示,飽和lx106Raji細胞分別需要diascFv2E8、diascFv2E8-Fc、scFv2E8-P53和2E8-FITC抗體的量為2.1μg、 1.5μg、2.0μg和1.5μg；阻滯實驗發(fā)現(xiàn),多價抗體對親本2E8的阻滯作用均優(yōu)于單價抗體,且四價抗體diascFv2E8-Fc效果最佳；RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)各目的基因已成功轉(zhuǎn)染至CHO真核細胞；細胞免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞CHO/diascFv2E8、 CHO/diascFv2E8-Fc和CHO/scFv2E8-P53胞漿內(nèi)均可見清晰的綠色熒光,說明上述三種轉(zhuǎn)染細胞均已成功表達融合蛋白；通過競爭結(jié)合實驗計算scFv2E8、 diascFv2E8、scFv2E8-P53和diascFv2E8-Fc蛋白的相對親和力常數(shù)為：1×1010M-1、 4×1010M-1、1.6×1011M-1和4×1011M-1；內(nèi)化實驗顯示,二價抗體diascFv2E8較單價抗體scFv2E8內(nèi)化快。但兩種四價抗體diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53蛋白內(nèi)化率與單價scFv2E8相比沒有明顯差異；解離率實驗顯示四價抗體的解離速率明顯低于雙價及單價抗體；凋亡實驗顯示：四價抗體diascFv2E8-Fc誘導(dǎo)的凋亡作用最強,優(yōu)于二價抗體diascFv2E8,單價scFv2E8抗體幾乎沒有促凋亡的作用；四價抗體diascFv2E8-Fc的ADCC作用強于scFv2E8-Fc抗體；在抗體高濃度時(50μg/ml, 25μg/ml),四價抗體diascFv2E8-Fc的CDC作用強于scFv2E8-Fc抗體；SDS-PAGE和Western Blot結(jié)果顯示,diascFv2E8、diascFv2E8-Fc和scFv2E8-P53蛋白產(chǎn)物均以混合體的形式存在。4多價抗體的血液系統(tǒng)腫瘤動物模型體內(nèi)治療作用研究伯基特淋巴瘤動物模型建立成功；發(fā)病小鼠出現(xiàn)體重下降,后肢癱瘓,并伴有脊柱側(cè)彎、弓背、呈惡病質(zhì)；HE染色和免疫組化(抗人CD19抗體標記)檢測結(jié)果顯示,發(fā)病小鼠腦膜均有腫瘤細胞浸潤,免疫組化染色可見褐黃色腫瘤細胞浸潤腦膜；生存分析顯示,各組間的生存時間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。四價抗體在體內(nèi)治療作用優(yōu)于二價及單價抗體,尤以四價抗體diascFv2E8-Fc的體內(nèi)治療效果最好。結(jié)論：1、二價抗體pcDNA3.1/diascFv2E8及兩種四價抗體pcDNA3.1/diascFv2E8-Fc和pcDNA3.1/scFv2E8-P53真核表達載體構(gòu)建成功。2、二價diascFv2E8和四價diascFv2E8-Fc及scFv2E8-P53多聚體蛋白在真核細胞CHO中成功表達。這些多價抗體都能夠識別表達CD19抗原分子的Raji細胞。3、體外功能試驗顯示：四價抗體的親和力顯著優(yōu)于二價及單價抗體,尤以四價抗體diascFv2E8-Fc的親和力最強；四價抗體的解離速率明顯低于雙價及單價抗體,半衰期延長,可以在體內(nèi)更好地發(fā)揮作用；多價抗體能引起明顯的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用；四價抗體diascFv2E8-Fc的ADCC和CDC作用強于人鼠嵌合單鏈抗體scFv2E8-Fc,提示多價抗體可以通過CDC、ADCC作用和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡更好地靶向殺傷腫瘤細胞。4、伯基特淋巴瘤動物模型建立成功；體內(nèi)功能試驗顯示,四價抗體在小鼠體內(nèi)治療作用優(yōu)于二價及單價抗體,尤以四價抗體diascFv2E8-Fc的體內(nèi)治療效果最好。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊衛(wèi)東;用基因工程技術(shù)制備多價微型抗體的研究[J];國外醫(yī)學(xué)(放射醫(yī)學(xué)核醫(yī)學(xué)分冊);1999年02期

，

本文編號：1737518