研究目的:腸道不僅是消化、吸收食物以供給人體養(yǎng)分的器官,更是人體最大的免疫器官,它不僅接觸大量食物抗原,還是眾多種共生菌定居的主要場所。為維持腸道穩(wěn)態(tài)和保護腸道免受外來病原菌侵襲,腸道粘膜免疫需要在保持對共生菌耐受的同時對外來病原菌的侵犯做出快速免疫反應(yīng)。在這一過程中,腸道免疫細胞(如:小腸上皮內(nèi)淋巴細胞)和腸道中表達的模式識別受體(如:Toll樣受體)發(fā)揮重要作用,但腸道粘膜免疫對于共生菌的耐受和區(qū)分共生菌及致病菌的具體機制還未完全闡明。腸道上皮層是腸道防御外來病原菌感染的第一道防線,它是由單層腸上皮細胞和位于上皮細胞間的上皮內(nèi)淋巴細胞組成。上皮內(nèi)淋巴細胞接受抗原刺激后可以快速起免疫反應(yīng),產(chǎn)生炎癥性細胞因子清除外來病原菌,同時上皮內(nèi)淋巴細胞可以對感染的上皮細胞進行殺傷進而清除病原菌。上皮細胞表達豐富的Toll樣受體,在外來菌感染時可以接受病原分子相關(guān)模式的刺激引起炎癥反應(yīng),分泌的細胞因子則對上皮內(nèi)淋巴細胞的活化和功能進行調(diào)節(jié)。兩者之間的相互作用中,作為模式識別受體之一的Toll樣受體在其中發(fā)揮重要作用。但目前,對于Toll樣受體在維持腸道穩(wěn)態(tài)和抵抗病原菌感染中的作用機制尚未完全闡明。鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium,ST)是一種革蘭氏陰性腸道致病菌,為食源性病原體,可以同時引起人類和動物的感染并導(dǎo)致自限性胃腸炎,表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、急性腸道炎癥及糞便樣本中存在中性粒細胞。它可以表達四種Toll樣受體的配體,TLR2的配體細菌脂蛋白,TLR4的配體LPS,TLR5的配體鞭毛蛋白以及TLR9的配體CpG DNA。本論文以鼠傷寒沙門氏菌分別灌胃感染不同TLR缺失小鼠,分析了 TLR2、TLR4和TLR9在小鼠抵抗鼠傷寒沙門氏菌感染中發(fā)揮的作用。通過對小鼠生存期、腸道病理損傷及小腸等組織細菌載量的檢測,發(fā)現(xiàn)TLR9缺失小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的感染最為敏感。進一步對TLR9在維持腸道完整性和抵抗鼠傷寒沙門氏菌感染中的作用及機制進行了深入探討。研究方法:1.灌胃感染鼠傷寒沙門氏菌,建立小鼠感染模型。通過對WT、TLR2-/-、TLR4-/-及TLR9-/-小鼠生存期、小鼠體重、小腸重量、肝臟重量、脾臟重量、腸道病理損傷(HE染色)、小腸組織及腸系膜淋巴結(jié)等處細菌載量的檢測,判斷小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染的敏感性。2.流式細胞術(shù)檢測鼠傷寒沙門氏菌感染后WT和TLR9-/-、鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細胞(iIELs)的絕對數(shù)、各亞群的比例及活化(CD69的表達)水平。3.乳酸脫氫酶(LDH)法檢測iIELs對小腸上皮細胞(IECs)和小腸上皮細胞系MODE-K的殺傷活性。4.流式細胞術(shù)檢測鼠傷寒沙門氏菌感染后ilELs各亞群NKG2D和殺傷相關(guān)分子CD107a的表達水平。5.Real-time PCR和流式細胞術(shù)檢測鼠傷寒沙門氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠IECs 表面 NKG2D 配體 MULT-1、RAE-1、H60 的表達。6.Real-time PCR和ELISA分別檢測鼠傷寒沙門氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠IECs中及小腸組織培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18、IL-8的水平。7.Western Blot和Real-time PCR檢測鼠傷寒沙門氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠IECs 中 NF-κB、p-NF-κB、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β的表達變化。8.流式細胞術(shù)檢測鼠傷寒沙門氏菌感染后WT和TLR9-/-小鼠iIELs表面IL-1RI的表達變化。流式細胞術(shù)檢測IL-1β刺激后iIELs各亞群CD69、NKG2D、CD107a的表達水平。9.LDH法檢測外加IL-1β刺激或阻斷IL-1β后iIELs對MODE-K細胞的殺傷作用。10.體內(nèi)將γδT細胞清除后檢測腸系膜淋巴結(jié)、肝臟及脾臟鼠傷寒沙門氏菌的載量。11.HE染色檢測iIELs轉(zhuǎn)輸小鼠和骨髓嵌合小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌后小腸組織的病理損傷程度。12.iIELs轉(zhuǎn)輸小鼠和骨髓嵌合小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌后檢測腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟鼠傷寒沙門氏菌載量。13.WT和TLR9-/-腹腔巨噬細胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后檢測胞內(nèi)鼠傷寒沙門氏菌的載量。14.流式細胞術(shù)檢測WT和TLR9-/-腹腔巨噬細胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后活化水平(CD86的表達)及ROS的含量。15.一氧化氮(NO)檢測試劑盒檢測WT和TLR9--腹腔巨噬細胞體外感染鼠傷寒沙門氏菌后上清中NO的含量。16.巨噬細胞轉(zhuǎn)輸小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌后檢測腸系膜淋巴結(jié)、肝臟、脾臟鼠傷寒鼠傷寒沙門氏菌菌的載量。研究結(jié)果:1.TLR9-/-小鼠較WT、TLR2-/和 TLR4-/--小鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染更為敏感6-8周齡的WT、TLR2-/-、TLR4-/-及TLR9-/-小鼠經(jīng)灌胃的方式感染鼠傷寒沙門氏菌(5×104CFU)后,TLR9-/-小鼠的生存期最短,小腸重量變化、肝臟及脾臟的腫大現(xiàn)象、小腸的病理損傷程度及細菌載量均較WT小鼠明顯。TLR2-/-和TLR4-/-與WT小鼠相比則明顯差異。說明TLR99-/-、鼠對鼠傷寒沙門氏菌感染最為敏感。2.鼠傷寒沙門氏菌感染后TLR9-/-小鼠小腸上皮內(nèi)淋巴細胞活化和殺傷功能明顯增強鼠傷寒沙門氏菌感染后,WT小鼠感染第七天時iIELs總數(shù)開始增加,而TLR9-/-小鼠在感染第五天iIELs總數(shù)即有明顯升高;TLR9-/-小鼠CD8α+TCRyδ+iIELs亞群的比例和絕對數(shù)在感染后較WT小鼠明顯增加;并且CD8α+TCRγδ+iIELs亞群活化(CD69表達)在感染第五天和第七天時均較WT小鼠明顯增加。進一步分析iIELs功能,發(fā)現(xiàn)TLR9-/-小鼠iIELs對原代小腸上皮細胞(IECs)和小腸上皮細胞系MODE-K細胞的殺傷活性均高于WT小鼠;TLR9-/-小鼠iIELs各亞群的表達NKG2D和殺傷相關(guān)分子CD107a均高于WT小鼠;同時IECs表面NKG2D配體(MULT-1,RAE-1,H60)的表達亦較WT小鼠明顯增高;體外用NKG2D中和抗體處理iIELs后其殺傷功能降低。結(jié)果提示,TLR9-/-小鼠iIELs的對感染的小腸上皮細胞的殺傷能力明顯提高,且殺傷依賴NKG2D對其配體的識別。3.TLR9缺失致IECs炎癥通路活化并促進NKG2D配體的表達發(fā)現(xiàn)感染后TLR9-/-小鼠IECs IL-1β、IL-8、NF-1κB和p-NF-κB表達量均明顯高于WT小鼠;NF-κB抑制劑PDTC可以完全逆轉(zhuǎn)傷寒沙門氏菌感染所引起的NKG2D配體(MULT-1,RAE-1,H60)的上調(diào),說明TLR9缺失促進鼠傷寒沙門氏菌感染時IECs NKG2D配體表達的上調(diào)是NF-κB信號通路依賴的。進一步觀察到TLR9-/-小鼠IECs中NLRP3炎癥小體通路相關(guān)分子和IL-1β的表達均高于WT小鼠;體外感染MODE-K細胞時同時抑制caspas-1,IL-1β的分泌量明顯下降,說明IL-1β的產(chǎn)生與NLRP3炎癥小體通路相關(guān);體外IL-1β刺激和鼠傷寒沙門氏菌感染MODE-K細胞均可上調(diào)NKG2D配體(MULT-1,RAE-1,H60)的表達。說明TLR9的缺失增強鼠傷寒沙門氏菌感染時IECs NF-1κB信號通路和NLRP3炎癥小體的活化,IL-1β經(jīng)caspase-1的剪切成熟并上調(diào)NKG2D配體的表達。4.IL-1β刺激iIELs活化并增強其殺傷功能在用流式細胞術(shù)證明鼠iIELs表面表達IL-1RI的基礎(chǔ)上,觀察到TLR9-/-小鼠感染后iIELs IL-1RI表達量明顯高于WT小鼠;體外用IL-1β刺激及中和IL-1β證明IL-1β可以促進iIELs的活化和功能。5.IECs TLR9的缺失導(dǎo)致鼠傷寒沙門氏菌感染時腸道的過度損傷通過iIELs過繼轉(zhuǎn)輸實驗證明iIELs TLR9的缺失并不會促進小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌時的腸道損傷和感染播散;進一步通過骨髓嵌合模型實驗證明,IECs TLR9的缺失促使腸道損傷更為嚴重,并促進鼠傷寒沙門氏菌穿過腸粘膜屏障向腸系膜淋巴結(jié)、肝臟和脾臟擴散。6.TLR9促進巨噬細胞活化及其殺菌功能發(fā)現(xiàn)TLR9缺失的巨噬細胞活化、殺菌物質(zhì)的產(chǎn)生和殺菌能力明顯降低,說明TLR9的缺失明顯削弱了巨噬細胞的活化和殺菌能力。進一步通過巨噬細胞過繼轉(zhuǎn)輸實驗證實TLR9的表達對于巨噬細胞有效清除胞內(nèi)菌的感染是必不可少的。結(jié)論:1.TLR9-/-小鼠對鼠傷寒沙門氏菌的感染較WT小鼠更為敏感;2.TLR9-/-小鼠iIELs(尤其是CD8α+TCRγδ+iIELs亞群)比例、活化和殺傷活性明顯高于WT小鼠;3.鼠傷寒沙門氏菌感染時,TLR9-/-小鼠iIELs NKG2D的表達和IECs NKG2D配體的表達較WT小鼠更強,促進了 iIELs對IECs的殺傷;4.TLR9通過對NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體活化的抑制作用,抑制IL-1β等炎癥因子的產(chǎn)生;5.IL-1β促進iIELs的活化和NKG2D的表達,增強iIELs對IECs的殺傷功能。6.TLR9增強巨噬細胞的活化和殺菌功能,在清除胞內(nèi)菌的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：1713372