本文選題：1型糖尿病　切入點(diǎn)：間充質(zhì)干細(xì)胞　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的:利用小鼠1型糖尿病(type 1 diabetes,T1D)模型,探討Wip1在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)治療T1D中的調(diào)控作用和Wip1缺失對(duì)MSCs免疫調(diào)節(jié)能力的影響,闡明MSCs治療T1D的機(jī)制,為MSCs的臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.小鼠T1D模型的建立。分別對(duì)小鼠給予連續(xù)小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立緩慢模型(slow-type model)或單次大劑量腹腔注射鏈脲佐菌素建立快速模型(fast-type model)。比較兩種模型小鼠的血糖變化、體重改變、生存狀態(tài)及胰島病理學(xué)改變,選擇最佳建模方法。2.分離培養(yǎng)Wip1野生型(Wip1~(+/+))MSCs和Wip1缺失型(Wip1~(-/-))MSCs。取1周齡乳鼠鼠尾提取基因組DNA,行Wip1基因型鑒定,分別從Wip1~(+/+)和Wip1~(-/-)小鼠的骨實(shí)質(zhì)組織提取并培養(yǎng)MSCs;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測MSCs細(xì)胞表型;誘導(dǎo)MSCs向成脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化,通過油紅O染色法檢測MSCs的成脂分化能力,堿性磷酸酶染色法檢測MSCs的成骨分化能力。3.Wip1在MSCs治療小鼠T1D中的作用。建立小鼠T1D模型,并給予Wip1~(+/+)MSCs或Wip1~(-/-)MSCs治療。通過監(jiān)測隨機(jī)血糖變化;HE染色和胰島素免疫組化染色檢測胰島病理改變情況;流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測脾臟T細(xì)胞亞群與炎性因子的表達(dá)差異;HE染色、Masson染色、PASM染色和RT-PCR檢測腎臟病變程度,比較Wip1~(+/+)MSCs與Wip1~(-/-)MSCs對(duì)小鼠T1D模型治療效果的差異。4.Wip1調(diào)控MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的作用機(jī)制。對(duì)T1D模型小鼠分別輸注熒光標(biāo)記的Wip1~(+/+)MSCs和Wip1~(-/-)MSCs,分別于第3天和第7天收取小鼠脾臟,病理組織切片法結(jié)合免疫熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測MSCs的歸巢能力,RT-PCR檢測脾淋巴細(xì)胞內(nèi)Notch1與Hes1的表達(dá)水平;并通過免疫組織化學(xué)法檢測NICD的活化情況;同時(shí)在體外將DC分別與Wip1~(+/+)MSCs或Wip1~(-/-)MSCs共培養(yǎng),檢測MSCs對(duì)DC成熟及DC內(nèi)Notch1及Hes1表達(dá)水平的影響。結(jié)果:1、兩種模型建立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,緩慢模型與快速模型的小鼠胰島組織均受到明顯破壞,表現(xiàn)為胰島β細(xì)胞減少,血糖上升。但是緩慢模型組小鼠的體重下降較緩慢,血糖呈現(xiàn)逐步上升趨勢,建模后8周內(nèi)總死亡率為10%;而快速模型組小鼠體重下降迅速,建模早期血糖急劇上升,建模后8周內(nèi)總死亡率為35%。緩慢模型血糖變化符合不接受干預(yù)的臨床患者血糖變化規(guī)律,同時(shí)可避免因高死亡率造成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差,因此,本研究選用小鼠T1D緩慢建模法。2、利用骨片分離法分離獲得Wip1~(+/+)MSCs與Wip1~(-/-)MSCs,細(xì)胞形態(tài)呈長梭形,傳至3代后Wip1~(-/-)MSCs的生長速度顯著低于Wip1~(+/+)MSCs;流式細(xì)胞術(shù)檢測兩種MSCs細(xì)胞表型,結(jié)果顯示,均高表達(dá)CD29、Sca-1及CD90;不表達(dá)CD11b、CD34、CD45、CD31及MHCII;其中Wip1~(-/-)MSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,脂滴的大小、密度較Wip1~(+/+)MSCs更小更細(xì);向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后,Wip1~(-/-)MSCs的堿性磷酸酶活性也低于Wip1~(+/+)MSCs。3、將Wip1~(+/+)MSCs與Wip1~(-/-)MSCs分別輸注小鼠T1D模型,結(jié)果表明,Wip1~(-/-)MSCs較Wip1~(+/+)MSCs抑制血糖升高和保護(hù)胰島β細(xì)胞的能力均減弱,且降低Th1/Th2比值、下調(diào)炎性因子IFN-γ、TNF-α的表達(dá)以及上調(diào)IL-4、IL-10、IL-17、Foxp3表達(dá)的能力亦顯著低于Wip1~(+/+)MSCs。Wip1~(-/-)MSCs治療組的腎臟器官中TGF-β1/SMAD通路激活水平明顯高于Wip1~(+/+)MSCs治療組,I型膠原纖維的表達(dá)水平高,Masson染色顯示腎小球纖維化增多;同時(shí)PASM染色顯示W(wǎng)ip1~(-/-)MSCs治療組小鼠腎小球系膜基質(zhì)含量多于Wip1~(+/+)MSCs治療組。4、Wip1缺失對(duì)MSCs歸巢能力影響的研究結(jié)果表明,輸注Wip1~(+/+)MSCs與Wip1~(-/-)MSCs治療T1D模型鼠,第3d或第7d歸巢至脾臟的細(xì)胞數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;Wip1~(+/+)MSCs治療組脾細(xì)胞Notch1活化片段NICD含量高于Wip1~(-/-)MSCs治療組,且Wip1~(+/+)MSCs治療組脾細(xì)胞中Notch1和Hes1的mRNA表達(dá)水平也顯著高于Wip1~(-/-)MSCs治療組;進(jìn)一步,將DC與Wip1~(+/+)MSCs或Wip1~(-/-)MSCs體外共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)Wip1~(-/-)MSCs促進(jìn)DC內(nèi)Notch信號(hào)通路活化的能力減弱。結(jié)論:Wip1缺失導(dǎo)致MSCs分化能力下降,Wip1~(-/-)MSCs保護(hù)胰島功能,恢復(fù)T1D小鼠免疫平衡,緩解糖尿病腎臟病變的能力均弱于Wip1~(+/+)MSCs,這可能與Wip1缺失抑制了MSCs激活免疫細(xì)胞內(nèi)Notch1/Hes1信號(hào)通路的能力,不能有效改善T1D的免疫狀態(tài)有關(guān)。
[Abstract]:Objective: the use of type 1 diabetic mice (type 1 diabetes, T1D) model of Wip1 in mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cells, MSCs) of regulation and Wip1 deletion in T1D treatment on MSCs immune regulation ability, clarifying the mechanism of MSCs treatment of T1D, to provide theoretical and experimental basis for the clinical application of MSCs methods: 1.. To establish the mouse model of T1D. Respectively in mice given continuous low dose intraperitoneal injection of streptozotocin (streptozotocin, STZ) (slow-type model) a slow model or a single large dose intraperitoneal injection of streptozotocin (fast-type model). The model of rapid change in body weight changes in blood glucose, two a mouse model of pathological changes, survival state and islet pathology, select the best modeling method of.2. isolated from wild type Wip1 (Wip1~ (+ / +) and Wip1 (MSCs) deletion type Wip1~ (- / -)) MSCs. 1 week old suckling mouse tail genomic DNA extraction, Wip1 base For type identification, respectively from Wip1~ (+ / +) and Wip1~ (- / -) mice bone parenchyma of isolated and cultured MSCs; cell morphology was observed under inverted microscope, to detect the phenotype of MSCs cells by flow cytometry; inducing MSCs into adipocytes and osteoblast differentiation and adipogenic differentiation ability of MSCs was detected by oil red O staining, alkaline phosphatase staining and osteogenic differentiation ability of.3.Wip1 mice with T1D in MSCs MSCs was detected. A rat model of T1D, and Wip1~ (+ / +) MSCs or Wip1~ (- / -) MSCs treatment. By monitoring the random blood glucose changes; HE staining and immunohistochemical staining of insulin islet pathological changes; flow cytometry and RT-PCR to detect the expression of splenic T cell subsets and inflammatory factor differences; HE staining, Masson staining, PASM staining and RT-PCR detection of renal lesions, compared with Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) effect of MSCs on mice with T1D model The mechanism of the difference of.4.Wip1 regulation of immune function of MSCs. The T1D mice were infused with fluorescent Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) MSCs, a mouse spleen at third days and seventh days respectively, immunofluorescence cell count MSCs homing histological method, the expression level of RT-PCR detection Notch1 and Hes1 in splenic lymphocytes; and through the activation of NICD was detected by immunohistochemical method and in vitro; DC and Wip1~ (+ / +) MSCs or Wip1~ (- / -) co culture MSCs, MSCs and DC detection of DC mature Notch1 and Hes1 expression. Results: 1, two models the experimental results show that the slow and rapid model mouse islet tissue was obviously damaged, as islet beta cells decreased, but the slow rise in blood sugar. The weight of model mice decreased slowly, blood sugar showed a gradual upward trend Modeling potential, the total mortality after 8 weeks was 10%; and the weight fast model mice decreased rapidly, modeling early sharp rise in blood glucose, total mortality within 8 weeks after modeling for 35%. model with slow changes in blood glucose blood glucose changes of clinical patients not receiving the intervention, but also can avoid the experimental results due to high mortality bias, therefore in this study, using mice T1D slow modeling method.2, using bone slices isolated by Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) MSCs cells were long fusiform, spread to the 3 generation of Wip1~ (- / -) the growth rate of MSCs was significantly lower than that of Wip1~ (+) MSCs; flow cytometry two the phenotype of MSCs cells, results showed that both high expression of CD29, Sca-1 and CD90; the expression of CD11b, CD34, CD45, CD31 and MHCII; Wip1~ (- / -) MSCs induced differentiation into adipocytes, lipid droplet size, the density is Wip1~ (+ +) MSCs smaller and more fine; osteogenic induction After the Wip1~ (- / -) MSCs alkaline phosphatase activity was lower than that of Wip1~ (+ / +) MSCs.3, Wip1~ (+ / +) MSCs and Wip1~ (- / -) MSCs mice were infused T1D model, the results show that the Wip1~ (- / -) MSCs Wip1~ (+ / +) MSCs to blood sugar control and protection of islet beta cells were weakened, and reduce the ratio of Th1/Th2, down-regulation of inflammatory factor IFN- gamma, alpha TNF- expression and upregulation of IL-4, IL-10, IL-17, Foxp3 expression was significantly lower than that of Wip1~ (+) MSCs.Wip1~ (- / -) MSCs treatment group of kidney TGF- beta 1/SMAD pathway activation levels were significantly higher in Wip1~ (+ / +) MSCs treatment group, the expression level of collagen I, Masson staining showed increased glomerular fibrosis; and PASM staining showed that the Wip1~ (- / -) MSCs treatment group mice glomerular mesangial matrix content of more than Wip1~ (+ / +) MSCs.4 treatment group, the effect of Wip1 deletion on MSCs homing ability. The results showed that infusion of Wip1~ (+) MSCs With Wip1~ (- / -) MSCs treatment of T1D model rats, there was no significant difference in cell number 3D or the 7d homing to the spleen; Wip1~ (+ / +) MSCs treatment group spleen cell activation of Notch1 fragment of NICD was higher than that of Wip1~ (- / -) MSCs treatment group and Wip1~ (+ / +) expression of MSCs Notch1 and Hes1 group treated spleen cells the level of mRNA was significantly higher than that in Wip1~ (- / -) MSCs treatment group; further, DC and Wip1~ (+ / +) MSCs or Wip1~ (- / -) MSCs co cultured in vitro, found that Wip1~ (- / -) MSCs promotes weakened DC Notch signaling pathway. Conclusion: Wip1 MSCs led to a lack of differentiation ability, Wip1~ (-) MSCs protect islet function, restore the immune balance of T1D mice, alleviate diabetic nephropathy were weaker than Wip1~ (+ / +) MSCs, which may be related to the deletion of Wip1 inhibited MSCs activation ability of immune cells in the Notch1/Hes1 signaling pathway, can effectively improve the immune state of the T1D.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.1;R-332

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本文編號(hào)：1695344