發(fā)布時間：2018-03-30 23:41

  本文選題：α2-巨球蛋白　切入點：Cohn組分IV　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文

【摘要】：α2-巨球蛋白(α2-Macroglobulin,α2-M)是一種大分子糖蛋白,其主要存在于血漿中,屬于巨球蛋白超家族的一員。α2-M是由4個相同的單體組成的同源四聚體,每個單體均含有五個功能區(qū)域,這決定了其特性及生物學功能。α2-M能夠廣泛的參與機體的生理及病理活動,其最基本的功能是作為廣譜的蛋白酶抑制劑清除內(nèi)源性及外源性蛋白酶。有研究表明α2-M具有一定抗輻射作用,在治療放射性肺炎、膀胱炎及其他放射性皮膚黏膜潰瘍時效果良好。α2-M還能夠與一些重要的細胞因子結(jié)合并調(diào)節(jié)其生物活性。除此之外,α2-M還能夠抑制腫瘤及參與凝血平衡并作為診斷或預測某些疾病的生物標記物。對于α2-M一些生物特性及制備工藝研究的深入將有助于推進α2-M在臨床治療的應(yīng)用�？捎糜谥苽洇�2-M的原料血漿是非常有限的,尤其是在發(fā)展中國家。當前血漿主要用于制備免疫球蛋白、白蛋白和凝血因子,直接以血漿為原料制備α2-M則并不現(xiàn)實。Cohn組分IV(Cohn Fraction IV,Cohn F IV)是基于乙醇沉淀的Cohn氏分離過程中一個副產(chǎn)物,但其中富含大量的α2-M。因此以Cohn F IV作為原料純化制備α2-M能夠起到綜合利用血漿的目的�；谏鲜霰尘�,本研究主要分為以下四個方面。(1)α2-M實驗室制備工藝的建立α2-M的活性測定在純化制備過程中是必不可少的質(zhì)控指標。作為一種蛋白酶抑制劑,α2-M能夠與蛋白酶相互作用形成“α2-M-蛋白酶復合物”。與其他蛋白酶抑制劑不同,α2-M并不會破壞蛋白酶的活性位點。因此與α2-M結(jié)合的蛋白酶并沒有失活,而僅僅是由于空間屏障作用,失去了與大分子底物作用的機會。BAPNA是一種小分子底物,能夠穿過空間屏障與蛋白酶的活性位點相互作用。通過檢測410 nm吸光值可以從側(cè)面考察與α2-M結(jié)合的蛋白酶量。在測活的反應(yīng)體系中,胰蛋白酶、BAPNA、大豆胰蛋白酶抑制劑(Soybean Trypsin Inhibitor,SBTI)的量需要首先被確定。此外還需要建立α2-M標準曲線。通過這種發(fā)色底物的原理建立了α2-M活性測定方法。關(guān)于從Cohn F IV純化制備PC、Tf、AAT的研究已經(jīng)有所報道。盡管α2-M在Cohn F IV中含量很大,但是并沒有關(guān)于將其從Cohn F IV分離純化的研究報道。之前關(guān)于α2-M純化制備的研究主要是綜合利用凝膠過濾、免疫吸附層析、Cibacron藍色瓊脂糖層析等方法。本研究中通過二維電泳的方法初步考察了Cohn F IV的蛋白組成。嘗試了鹽析法、Capto TM Core 700層析介質(zhì)、Aerosil 380、Planova TM 35N濾器在α2-M純化方面的效果。由于α2-M是一個大分子的鋅離子結(jié)合蛋白,因此我們采用了鋅離子親和層析、凝膠過濾的方法純化α2-M。經(jīng)過藍色瓊脂糖親和層析后,最終獲得了純度98%的α2-M,工藝的活性回收率在48%左右。利用質(zhì)譜的方法定性鑒定了終產(chǎn)品,考察了不同溫度、p H、不同濃度甲胺對α2-M活性的影響,這為α2-M純化及保存過程避免活性損失提供了幫助。實驗結(jié)果顯示在溫度高于50℃、p H高于9.0、p H小于4.0及甲胺存在的條件下,α2-M的活性很容易損失。(2)從Cohn F IV中規(guī)�；苽涓呒儲�2-M關(guān)于α2-M純化制備的報道有很多,但是可能存在的一些問題會制約這些制備工藝的進一步應(yīng)用。1.幾乎所有的純化方法使用的純化原料均為人血漿,但當前以血漿作為原料制備α2-M是不現(xiàn)實的。2.有些純化工藝不能同時取得高純的α2-M及較高的回收率。免疫吸附雖然是一個很有效的方法,但是應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的成本較高。3.很少有關(guān)于α2-M大規(guī)模制備的工藝報道。雖然利凡諾法曾經(jīng)被報道可用于α2-M規(guī)�；苽�,但是20世紀90年代中國政府禁止了利凡諾用于人血液制品的制備。4.很多報道的工藝要求血漿中Hp的類型為1-1型,而該Hp型人群的比例僅為14.5%。本研究中的純化工藝基于鹽析法、鋅離子親和層析、超濾法,以Cohn F IV為原料獲得了高純的α2-M。通過質(zhì)譜分析及氨基酸組成分析證實,獲得的終產(chǎn)品為α2-M。據(jù)我們所知,這應(yīng)該是首先從Cohn F IV分離純化α2-M的研究。從Cohn F IV制備α2-M提高了血漿利用率,并且本方法無需要求血漿中Hp的類型。經(jīng)過三批次規(guī)�；苽�,獲得了280瓶α2-M(40 mg/瓶)。終產(chǎn)品的純度為94.9%,比活為26.7μg/mg,工藝平均收率為20.5%。根據(jù)三批次產(chǎn)品質(zhì)量,初步建立了α2-M質(zhì)量標準,純度、比活等核心指標被重新設(shè)定。制備工藝中使用的鋅離子親和層析介質(zhì)價格便宜、線性流速快、抗壓,這有利于規(guī)�；a(chǎn)。(3)α2-M純化制備工藝中病毒滅活方法的優(yōu)化之前關(guān)于使用不安全血漿來源的血漿蛋白制品感染HIV、HBV、HCV等病毒的事件是有所報道的。即使現(xiàn)在病毒滅活/去除工藝已經(jīng)極大提高了病毒安全性,使用人血來源的血液制品時仍然存在感染血源性病原體的風險。巴氏滅活、干熱、電離輻射、S/D法、層析法等滅活/去除病毒的方法已經(jīng)被報道用于血漿蛋白制品的制備工藝中。本研究選取了不同理化性質(zhì)的病毒,考察巴氏滅活、干熱、電離輻射、S/D法、層析法在α2-M工藝中病毒滅活/去除的效果。優(yōu)化了巴氏滅活、干熱、電離輻射過程中的保護劑。實驗結(jié)果顯示無保護劑時巴氏滅活和干熱法能夠有效的滅活有囊膜病毒和無囊膜病毒。25 k Gy劑量輻照能夠?qū)⒅甘静《就耆珳缁?但有將近40%α2-M活性受到損失。S/D法可以有效的滅活有囊膜病毒,層析法也能夠一定程度當去除病毒。血液制品病毒滅活要求工藝中至少有兩種互補的病毒滅活方法。根據(jù)我們的研究結(jié)果,在今后的進一步應(yīng)用中從巴氏滅活、干熱法、S/D法中選擇兩種滅活方法是十分必要的。本研究為今后α2-M工業(yè)制備中病毒滅活方法的選擇奠定基礎(chǔ)。(4)α2-M重要生物學功能的研究有報道稱α2-M對輻射引發(fā)的皮膚和粘膜潰瘍、放射性肺炎、放射性膀胱炎、角膜炎和角膜潰瘍治療效果良好。鑒于上述研究基礎(chǔ),我們選擇了α2-M作用受體較多的L-929細胞開展研究�？疾炝甩�2-M對輻射后L-929細胞增殖、活性氧產(chǎn)生和細胞凋亡的影響。將α2-M用于經(jīng)受7.25、8.00 Gy照射后的小鼠,并考察小鼠存活和體重變化。此外我們研究了α2-M對紅細胞保存的影響,檢測了血常規(guī)、血氣、晶體滲透壓、游離血紅蛋白等指標。研究顯示α2-M能夠顯著提高L-929細胞的增殖、降低其活性氧產(chǎn)生及抑制細胞凋亡,這些結(jié)果能夠一定程度的解釋α2-M的抗輻射作用。然而經(jīng)過α2-M治療后,并沒有對照射后小鼠的體重恢復、存活率帶來積極作用。經(jīng)過α2-M孵育后紅細胞溶血情況比較嚴重,因此α2-M并沒有表現(xiàn)出較好的紅細胞保存作用,相關(guān)方面的研究正在進行中。動脈粥樣硬化是缺血性心臟病、中風、外周動脈疾病和慢性腎臟病等疾病的一個主要誘發(fā)因素。迄今缺血性心臟病和中風仍然是世界上引起死亡人數(shù)最多的兩種疾病。過去三十年來,通過有效的預防、具有降脂效果的他汀類藥物和血管成形術(shù)的治療,動脈粥樣硬化等冠狀動脈心臟病的死亡率已經(jīng)有所下降,但死于這種疾病人數(shù)仍然遠超其他疾病。發(fā)展中國家動脈粥樣硬化心血管疾病的發(fā)病率正在迅速增加,以至于每年花費在該病預防治療方面的費用超過了癌癥、慢性阻塞性肺病和糖尿病等其他一些主要引起死亡的疾病。目前,對于動脈粥樣硬化的治療主要是結(jié)合藥物和手術(shù)綜合治療。使用的藥物主要是具有減輕高脂血癥、降血壓或預防血栓形成并發(fā)癥效果的他汀類藥物、煙酸、阿司匹林、β-受體阻斷劑或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑。血管成形術(shù)/支架術(shù)和冠狀動脈搭橋手術(shù)也常結(jié)合藥物治療動脈粥樣硬化。血管內(nèi)支架置入以防止收縮性血管重塑已經(jīng)成功地在一定程度上減少血管手術(shù)后再狹窄的發(fā)生率,但是手術(shù)后3至6個月內(nèi)患者發(fā)生動脈晚期再狹窄的概率仍然高達30%至50%,且這些患者發(fā)生嚴重急性心血管事件的風險仍然非常高。新生內(nèi)膜增生是動脈粥樣硬化和支架術(shù)后再狹窄的一個主要病理過程。一種可能的機制表明新生內(nèi)膜來源于從中膜向內(nèi)膜異常增殖和遷移的平滑肌細胞。受機械損傷后內(nèi)皮發(fā)生變性并釋放細胞因子,這些釋放的細胞因子會激活平滑肌細胞并促進其增殖和遷移。血管成形術(shù)均會損傷內(nèi)皮,但并非所有接受手術(shù)的患者都會發(fā)生血管再狹窄。因此,一些其它因素對手術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生發(fā)揮重要作用。最近的一些研究指出血管狹窄可能受到遺傳因素的影響。目前新生內(nèi)膜病變的發(fā)生發(fā)展是否也受遺傳因素的影響尚未在載脂蛋白E敲除小鼠品系中開展研究。Rcn2是一種新的細胞因子表達調(diào)節(jié)因子,其是否為動脈粥樣硬化易感基因也不得而知。氯化鉀和性別對心臟性疾病的發(fā)生發(fā)展有一定影響,至于其對動脈粥樣硬化的作用尚不得而知�；谏鲜霰尘�,本研究分為以下三章。(1)六種不同品系小鼠載脂蛋白E敲除后動脈粥樣硬化易感性差異及機制研究頸動脈的血管重塑是許多心血管疾病如動脈粥樣硬化和高血壓的重要病理過程。在頸總動脈分叉附近結(jié)扎后造成的頸總動脈重塑的模型常被用于血管重塑的研究。在本研究中,將這種動脈重塑模型應(yīng)用于六種不同的近交系小鼠。在新生內(nèi)膜形成,管腔面積增加及血管壁肥大等方面觀察到了顯著的差異。除C3H外,其他5種品系小鼠的結(jié)扎側(cè)頸總動脈呈現(xiàn)出正向重塑,與對側(cè)管腔面積相比,B6、BAL SM F1、SWR、BALB、SMJ的結(jié)扎側(cè)管腔分別增加171%、63%、38%、15%、12%。除C3H和BAL SM F1外,其他4種品系小鼠的結(jié)扎側(cè)血管壁面積顯著增加,與對側(cè)血管壁面積相比B6、SWR、BALB、SMJ分別增加209%、170%、79%、68%。與其他品系小鼠相比B6結(jié)扎側(cè)血管壁面積的增加是顯著的。對于B6、SWR、BAL SM F1、BALB小鼠來說,結(jié)扎側(cè)血管壁中細胞數(shù)是顯著多于對側(cè)的。這表明細胞增多是血管壁面積擴大的一個主要因素。SWR和B6小鼠在頸總動脈結(jié)扎后容易形成新生內(nèi)膜病變,但BALB,SMJ和C3H小鼠不容易形成病變。選用SWR小鼠生成的病變通過免疫染色的方法進行細胞成分分析。分別用抗-α-平滑肌肌動蛋白和MOMA-2抗體檢測平滑肌細胞和巨噬細胞。新生內(nèi)膜病變主要由存在于纖維帽附近的平滑肌細胞組成,但沒有觀察到巨噬細胞。由于病理過程中平滑肌細胞從靜止的收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?而抗-α-平滑肌肌動蛋白抗體屬于收縮平滑肌細胞的特異性抗體,因此大量的合成型平滑肌細胞并沒有發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)。選擇B6和C3H來源的平滑肌細胞來研究其增殖和遷移能力。研究顯示C3H平滑肌細胞的生長、遷移能力顯著弱于B6的平滑肌細胞。(2)Rcn2作為動脈粥樣硬化易感基因的鑒定結(jié)扎左頸總動脈研究基因Rcn2在動脈粥樣硬化的發(fā)病過程中的作用。Rcn2-/-小鼠是在B6 apo E-/-小鼠基礎(chǔ)上再敲除基因Rcn2獲得的。實驗中采用B6 apo E-/-小鼠作為對照。在本研究中分別采用高脂飲食和正常飲食飼養(yǎng)動物。在正常飲食條件下,結(jié)扎頸總動脈后Rcn-/-小鼠血管中沒有觀察到新生內(nèi)膜病變,但B6 apo E-/-小鼠血管中生成了較大的病變。在高脂飲食條件下,B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠血管中都形成了巨大的新生內(nèi)膜病變。B6 apo E-/-小鼠結(jié)扎側(cè)血管壁面積相比對側(cè)顯著增加,而在Rcn2-/-結(jié)扎側(cè)血管壁面積相比對側(cè)是減少的。在兩種飲食條件下,結(jié)扎后B6 apo E-/-小鼠的頸總動脈呈現(xiàn)正性重塑,其結(jié)扎側(cè)血管腔面積大于對側(cè)管腔面積。Rcn2-/-小鼠結(jié)扎動脈呈現(xiàn)負性重塑,其結(jié)扎側(cè)管腔面積是減少的。兩種飲食條件下,B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠在管腔面積方面的差異均是顯著的。通過免疫組織化學染色分析B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠新生內(nèi)膜病變中的細胞組成。正常飲食組B6 apo E-/-小鼠的新生內(nèi)膜病變主要由平滑肌細胞和少數(shù)灶性聚集的巨噬細胞組成。高脂飲食組在B6 apo E-/-小鼠的病變中觀察到一些灶性聚集的巨噬細胞。但由于從收縮型轉(zhuǎn)變成合成型,所使用的抗體檢測不到合成型平滑肌細胞。高脂飲食組Rcn2-/-小鼠的新生內(nèi)膜病變中充滿巨噬細胞,這完全不同于B6 apo E-/-小鼠。源于Rcn2-/-小鼠的內(nèi)皮細胞的遷移能力顯著弱于來自B6 apo E-/-小鼠的內(nèi)皮細胞。敲除Rcn2導致內(nèi)皮細胞增殖較慢,但該結(jié)果沒有統(tǒng)計學意義。(3)氯化鉀和性別對動脈粥樣硬化發(fā)病過程的影響性別和氯化鉀被認為是心臟性疾病發(fā)展過程中的兩個重要因素。我們之前觀察到血漿中Rcn2濃度與氯化鉀濃度呈明顯的負相關(guān)。在本研究中,對雄性和雌性B6apo E-/-小鼠進行頸動脈結(jié)扎,以研究不同性別之間動脈粥樣硬化易感性的差異。本研究還評估了氯化鉀對源自B6 apo E-/-和Rcn2-/-小鼠的內(nèi)皮細胞的增殖和遷移的影響。對比頸總動脈結(jié)扎后的雄性和雌性B6 apo E-/-小鼠,盡管兩者在新生內(nèi)膜病變、結(jié)扎側(cè)與對側(cè)血管壁面積差值、新生內(nèi)膜與結(jié)扎側(cè)血管壁面積比方面存在一定差異,但該差異沒有統(tǒng)計學意義。雄性小鼠的左側(cè)頸動脈呈現(xiàn)出正性重塑,結(jié)扎側(cè)血管腔比對側(cè)增加超過70%,而在雌性小鼠頸動脈呈現(xiàn)負性血管重塑。氯化鉀對從B6 apo E-/-和Rcn2-/-主動脈分離的內(nèi)皮細胞的增殖和遷移沒有顯著影響。可能是因為氯化鉀對細胞的作用是一種慢性過程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R392-33

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本文編號：1688214