本文選題：KDM5B　切入點：PARP1　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：目的:維持基因組的穩(wěn)定性是正常機體發(fā)育所必需的,并且對于預(yù)防癌癥等疾病至關(guān)重要�；虻男畔⒈话b進了染色質(zhì)中,越來越多的證據(jù)表明染色質(zhì)的環(huán)境在DNA損傷應(yīng)答中起了重要作用。但是,目前尚不完全清楚DNA修復(fù)是如何被表觀機制所調(diào)控的。本論文旨在研究賴氨酸特異的組蛋白去甲基化酶KDM5B在DNA雙鏈損傷應(yīng)答的各個方面所發(fā)揮的作用。方法與結(jié)果:1)通過細(xì)胞核內(nèi)蛋白質(zhì)組分分離實驗,發(fā)現(xiàn)在DNA損傷應(yīng)答時,KDM5B可以更多的與染色質(zhì)結(jié)合;2)在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染引入核酸內(nèi)切酶I-Sce1/AsiSI的識別序列,過表達I-Sce1/AsiSI核酸內(nèi)切酶質(zhì)粒誘導(dǎo)DNA雙鏈損傷,通過染色質(zhì)免疫共沉淀(Ch IP)實驗,發(fā)現(xiàn)KDM5B可以被招募到DNA雙鏈損傷位點附近的染色質(zhì)區(qū)域;3)通過免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)KDM5B與PARP1有相互作用,并且此作用在DNA損傷時增強,與之相對應(yīng)的,損傷時KDM5B的多聚腺苷二磷酸核糖化水平增高;4)分離與染色質(zhì)相結(jié)合的細(xì)胞核蛋白及全細(xì)胞裂解液發(fā)現(xiàn),敲低PARP1會影響DNA損傷時KDM5B與染色質(zhì)的結(jié)合,若加入PJ-34(PARP1的酶活性抑制劑),也會影響KDM5B在染色質(zhì)上的富集。通過定量染色質(zhì)免疫共沉淀(qCh IP)實驗,發(fā)現(xiàn)無論是PARP1的酶活性還是其與KDM5B的結(jié)合都影響KDM5B富集在DNA損傷區(qū)域的染色質(zhì)上;5)利用NHEJ-GFP系統(tǒng)以及HR-DRGFP系統(tǒng),通過FACS發(fā)現(xiàn)DNA雙鏈損傷時,KDM5B能影響NHEJ及HR的修復(fù)效率;6)引入KDM5B無酶活性的突變體,利用NHEJ-GFP系統(tǒng)以及HR-DRGFP系統(tǒng),通過流式細(xì)胞儀,發(fā)現(xiàn)KDM5B在DNA損傷中的作用依賴其去甲基化酶活性;進一步通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗,發(fā)現(xiàn)KDM5B能改變DNA損傷區(qū)域染色質(zhì)的H3K4me3水平;7)通過免疫熒光實驗以及peptide pull-down實驗發(fā)現(xiàn),DNA發(fā)生損傷時,KDM5B能招募BRCA1至損傷區(qū)域,影響其在損傷位點形成foci,且此作用依賴于KDM5B的去甲基化酶活性。但KDM5B對MDC1及gH2AX的IR后foci形成無影響;通過激光微束照射及免疫熒光實驗,發(fā)現(xiàn)在DNA發(fā)生損傷時,KDM5B還能招募Ku70至損傷區(qū)域,此過程同樣依賴于KDM5B的去甲基化酶活性;8)IR照射細(xì)胞或者加入NCS造成DNA雙鏈損傷,發(fā)現(xiàn)KDM5B能影響損傷后檢測點蛋白磷酸化水平;9)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,敲低KDM5B或者ATM并對細(xì)胞進行IR照射或者NCS處理,發(fā)現(xiàn)敲低KDM5B能增強細(xì)胞對基因毒性物質(zhì)的敏感性;10)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,給予細(xì)胞IR照射或者轉(zhuǎn)染siRNA等不同處理,發(fā)現(xiàn)KDM5B能影響細(xì)胞周期進程,敲低KDM5B能使細(xì)胞G1/S期過渡延遲,尤其是IR造成DNA損傷時,敲低KDM5B造成的對細(xì)胞周期的影響更加明顯;11)通過在p53+/+細(xì)胞及p53-/-細(xì)胞內(nèi)敲低KDM5B,Western blotting檢測p53通路相關(guān)蛋白表達水平,發(fā)現(xiàn)KDM5B能影響p53+/+細(xì)胞中p53通路相關(guān)蛋白表達水平,但對于p53-/-細(xì)胞中p53通路蛋白無影響;而用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)KDM5B對細(xì)胞周期的影響只有在表達p53的細(xì)胞中存在,KDM5B對細(xì)胞周期的影響依賴于p53;結(jié)論:細(xì)胞經(jīng)電離或內(nèi)切酶處理后,KDM5B能富集在DNA損傷區(qū)域,這個過程是依賴于PARP1的。KDM5B是有效修復(fù)DNA雙鏈損傷及招募Ku70與BRCA1的不可缺少的組分。KDM5B缺失能激活p53信號通路并使細(xì)胞對基因毒性損害更加敏感。此論文的結(jié)果證明KDM5B確實是一個DNA損傷反應(yīng)蛋白,指出KDM5B是一個重要的基因守護者,是基因組穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)者。此論文使人們深入理解表觀遺傳調(diào)控對維持基因穩(wěn)定的重要作用。
[Abstract]:Objective: normal body development required for maintaining genome stability, and for the prevention of cancer and other diseases is essential. Gene information is packaged into chromatin, more and more evidence that chromatin environment plays an important role in the DNA damage response. However, it is not entirely clear how DNA repair the apparent mechanism of regulation. This paper aims at demethylase KDM5B play in the various aspects of DNA double strand damage response of lysine specific histone function. Methods and results: 1) the nucleus protein separation experiments, found in response to DNA damage, KDM5B can be more binding with chromatin; 2) recognition sequence in cells by endonuclease I-Sce1/AsiSI after stable transfection, I-Sce1/AsiSI overexpression plasmid endonuclease induced DNA double strand damage, by chromatin immunoprecipitation ( Ch IP) experiment, found that KDM5B can be recruited to DNA double strand damage chromatin regions near the site; 3) by CO immunoprecipitation experiments showed that KDM5B interacted with PARP1, and this effect increased in response to DNA damage, and the corresponding damage, KDM5B poly adenosine ribose phosphate of two the increased level of nuclear protein; 4) separation and combination of chromatin and whole cell lysates showed that knockdown of PARP1 may affect the binding of KDM5B with chromatin during DNA damage, adding PJ-34 (enzyme inhibitor PARP1), will also affect the quality of the enrichment of KDM5B in dyeing. Co precipitation by quantitative chromatin immune (qCh IP) experiment, found that both the PARP1 activity or the combination of KDM5B and KDM5B are enriched in the influence of chromatin DNA damage area; 5) using NHEJ-GFP system and HR-DRGFP system, the FACS found that DNA double strand damage, KDM5B can affect the NHEJ The repair efficiency and HR; 6) the introduction of KDM5B enzyme activity of the mutant, using NHEJ-GFP system and HR-DRGFP system, by flow cytometry, found that the role of KDM5B in DNA damage dependent demethylase activity; further by chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments found that KDM5B could change DNA damage area the H3K4me3 level of chromatin; 7) by immunofluorescence assay and peptide pull-down assay showed that DNA damage, KDM5B recruits BRCA1 to the damaged area, affect the formation of foci in the injury site, and this effect depends on the KDM5B demethylase activity. But KDM5B MDC1 and gH2AX IR foci after the formation of no effect; by laser microbeam irradiation and immunofluorescence experiments, found that the injury occurred in the DNA, KDM5B can recruit Ku70 to the injured area, this process also depends on the KDM5B demethylase activity; 8) IR irradiated cells or add NC S caused DNA damage, KDM5B can detect the point of protein phosphorylation injury; 9) by flow cytometry, knockdown of KDM5B or ATM and IR or NCS irradiation treatment on the cell, found that knockdown of KDM5B can enhance the sensitivity of cells to genotoxic substances; 10) by cell cycle was measured by flow cytometry, IR cells transfected with siRNA irradiation or given different treatment, found that KDM5B can influence the cell cycle progression, knockdown of KDM5B can make the cell G1/S phase delay, especially IR caused DNA damage, caused by KDM5B knockdown on cell cycle effect is more obvious; 11) in p53+/+ cells knockdown of KDM5B and p53-/- cells, the expression level of Western blotting detection of p53 pathway related proteins and found that KDM5B can influence the p53+/+ cells in p53 pathway related protein expression level of p53-/- in p53 cells, but the protein has no effect and path; By flow cytometry, found that the influence of KDM5B on the cell cycle of p53 cells only in the expression, the effect of KDM5B on cell cycle dependent on p53; conclusion: cells by ionizing or enzyme treatment, KDM5B can be enriched in the DNA region of the injury, this process is dependent on the PARP1.KDM5B is effective in repairing DNA double strand breaks and the recruitment of Ku70 and BRCA1 is an indispensable component of the.KDM5B deletion could activate p53 signal pathway and make the cells more sensitive to genotoxic damage. The results indicate that KDM5B is indeed a DNA damage response protein, and points out that KDM5B is an important gene guardian, are regulators of genomic stability. This paper makes an understanding of epigenetic regulation plays an important role in maintaining genetic stability.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R3411

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本文編號：1677039