本文選題：瘧原蟲　切入點：脫氧核糖核酸酶　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：瘧原蟲對宿主的危害主要發(fā)生在血液期,即蟲體在宿主紅細(xì)胞內(nèi)的發(fā)育繁殖過程。然而,多年來對瘧原蟲的生物學(xué)及致病機理的解析一直存在著很多空白。這影響著疫苗的研制和抗瘧藥物的開發(fā)。在本實驗中,我們通過生物信息學(xué)分析首先分析潛在的能降解宿主免疫細(xì)胞胞外陷阱ETs(Extracellular Traps)結(jié)構(gòu)的分泌性DNase,即Tat D-like DNase,并分析其基序,結(jié)構(gòu)域和序列特性。結(jié)果顯示,瘧原蟲的Tat D-like DNAse是一種金屬依賴性的脫氧核糖核酸酶,其蛋白質(zhì)在不同瘧原蟲中的序列非常保守,并且在N端存在一個20個氨基酸左右的信號肽,這說明該蛋白質(zhì)具有分泌的潛力。進(jìn)一步,對Pf Tat D在瘧原蟲紅內(nèi)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行分析。用q PCR的方法對不同時期編碼Pf Tat D基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析;同時對Pf Tat D在瘧原蟲紅內(nèi)期的表達(dá)水平進(jìn)行western blot分析。結(jié)果顯示,Pf Tat D在瘧原蟲紅內(nèi)期全程轉(zhuǎn)錄表達(dá),并且在32小時達(dá)到轉(zhuǎn)錄高峰。我們采用間接免疫熒光和免疫電鏡的方法定位Pf Tat D在染蟲紅細(xì)胞內(nèi)的位置。定位結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測相符,蛋白質(zhì)存在于納蟲溶泡膜與染蟲紅細(xì)胞膜之間,并且具有向外分泌的趨勢。在鼠瘧原蟲相關(guān)實驗中,我們發(fā)現(xiàn)Tat D的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)和蟲體的毒力成正相關(guān),這也說明了該蛋白質(zhì)在蟲體致病中的作用。進(jìn)一步我們采用double crossover的方法敲除了P.berghei ANKA株編碼Pb Tat D的基因,獲得了缺陷表達(dá)Tat D的蟲株。對缺陷蟲株的毒力分析結(jié)果顯示,缺陷表達(dá)蟲株的感染能力和致死性都明顯下降。而將缺陷表達(dá)蟲株與巨噬細(xì)胞J774A.1體外共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)該蟲株可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ETs結(jié)構(gòu),并且產(chǎn)生的數(shù)量明顯高于野生型蟲株。這個結(jié)果說明了,瘧原蟲Tat D參與了蟲體逃避宿主ETs清除的過程。而在酶活實驗中,原核表達(dá)的Tat D蛋白質(zhì)可以體外降解宿主DNA,這也進(jìn)一步驗證了Tat D參與蟲體致病性逃避宿主清除機理的假說,即蟲體將Tat D蛋白質(zhì)釋放到胞外,通過其脫氧核糖核酸酶的活性降解宿主產(chǎn)生的ETs結(jié)構(gòu)中的DNA骨架來逃避其殺傷性作用。我們通過對小鼠免疫重組Pb Tat D和Pc Tat D蛋白質(zhì)評價該蛋白質(zhì)的免疫保護(hù)性。結(jié)果顯示免疫組的染蟲率要低于空白組和陰性組,并且小鼠的存活時間更長。而血清治療實驗的結(jié)果也與免疫保護(hù)試驗的結(jié)果相符。以上結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)作為一個蟲體致病相關(guān)蛋白質(zhì),參與了蟲體逃避宿主天然免疫的過程,并且具有作為紅內(nèi)期疫苗的候選抗原的潛力。本研究首次揭示了Tat D-like DNase蛋白質(zhì)作為瘧原蟲致病相關(guān)蛋白質(zhì),參與蟲體逃避NETs清除的過程,這對深入理解瘧原蟲逃避宿主天然免疫具有重要的意義,也為研制瘧疾疫苗提供了新的思路。
[Abstract]:The harm of Plasmodium to the host mainly occurs in the blood phase, that is, the development and reproduction of the parasite in the host erythrocyte. However, Over the years, there have been many gaps in the analysis of the biological and pathogenic mechanisms of Plasmodium. This has affected the development of vaccines and antimalarial drugs. By bioinformatics analysis, we first analyzed the secretory DNase, or Tat D-like DNase, which can degrade the host immune cell extracellular trap (ETs(Extracellular traps) structure, and analyzed its motif, domain and sequence properties. The Tat D-like DNAse of Plasmodium is a metal-dependent deoxyribonuclease, its protein is very conserved in different plasmodium, and there is a signal peptide of about 20 amino acids at the N-terminal. This indicates that the protein has the potential to secrete. Furthermore, the transcriptional expression level of PF Tat D in the erythroid phase of Plasmodium is analyzed. The transcription level of PF Tat D gene at different stages is analyzed by Q PCR method. At the same time, the expression of PF Tat D in the erythroid phase of Plasmodium was analyzed by western blot. The results showed that the expression of PF Tat D was transcriptional in the whole process of the erythrocytic phase of Plasmodium falciparum. We used indirect immunofluorescence and immunoelectron microscopy to locate the position of PF Tat D in the erythrocytes of the parasite. The localization results were consistent with the bioinformatics prediction. The protein exists between the foam membrane and the erythrocyte membrane, and has the tendency of exocrine secretion. We found that the transcription and expression of Tat D was positively correlated with the virulence of the parasite in the related experiments of Plasmodium falciparum. Further, we used double crossover method to knock out the gene encoding Pb Tat D of P.berghei ANKA strain, and obtained the strain with defective expression of Tat D. the virulence analysis to the defective strain showed that, The infection ability and lethal ability of the defective expression insect strain were obviously decreased, but co-cultured with macrophage J774A.1 in vitro, it was found that the strain could induce macrophage to produce ETs structure. The results show that the Tat D of Plasmodium parvum is involved in the process of evading host ETs clearance. The prokaryotic expression of Tat D protein can degrade the host DNA in vitro, which further verifies the hypothesis that Tat D is involved in the mechanism of pathogenicity escape from host, that is, the body releases Tat D protein to extracellular. The DNA skeleton in the ETs structure produced by its deoxyribonuclease activity was used to escape its lethal effects. We evaluated the immune protection of the protein by immunizing the recombinant Pb Tat D and PC Tat D proteins in mice. The results showed that the infection rate of immune group was lower than that of blank group and negative group. And the survival time of the mice was longer. And the results of the serum therapy experiment were consistent with the results of the immune protection test. It is involved in the process of parasite escaping from host innate immunity, and has the potential to be a candidate antigen for intrared vaccine. In this study, we first revealed that Tat D-like DNase protein is associated with Plasmodium plasmodium pathogenicity, and participate in the process of evading NETs clearance. This is of great significance to the understanding of malaria parasite escaping from host innate immunity, and also provides a new idea for the development of malaria vaccine.
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R382.31

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫翠英，劉迎春，吳勤;強化計劃免疫保護(hù)流動兒童健康[J];包頭醫(yī)學(xué);1996年01期

2 李輝，，李榮成，廖蘇蘇，楊進(jìn)業(yè)，曾憲嘉，王樹聲，李艷萍，龔健，潘利，張孔來，農(nóng)藝;國產(chǎn)乙型肝炎血源疫苗免疫保護(hù)持久性及加強免疫[J];中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報;1998年01期

3 陽豫,李東至,綜述;母乳的免疫保護(hù)機制[J];河南醫(yī)學(xué)研究;1999年03期

4 王春鳳,從彥龍;輪狀病毒感染的免疫保護(hù)機制[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報;2005年05期

5 鄭靈巧;;我國免疫保護(hù)范圍擴(kuò)展迅速專家提示科學(xué)規(guī)范嚴(yán)格管理[J];中國社區(qū)醫(yī)師(綜合版);2007年11期

6 黃英;輪狀病毒感染的免疫保護(hù)機制[J];國外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊;1997年03期

7 徐勤惠,榮康泰,惲榴紅;河豚毒素的免疫保護(hù)試驗[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2003年02期

8 岳紅云;賀翔鴿;;青光眼視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免疫保護(hù)研究進(jìn)展[J];眼科新進(jìn)展;2007年10期

9 易勇,鄒全明,程建平,毛旭虎,童文德,曾明,朱永紅,馬穎,王慶旭;Stx2B與IntiminC300融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及免疫保護(hù)研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年03期

10 邱振綱;何曉;黃才斌;張明霞;陳心春;;多功能Th1細(xì)胞在抗結(jié)核免疫保護(hù)機制中的作用研究進(jìn)展[J];臨床肺科雜志;2012年12期

相關(guān)會議論文 前8條

1 王春鳳;叢彥龍;;輪狀病毒感染的免疫保護(hù)機制[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

2 王毅超;鄒全明;;幽門螺桿菌能微球疫苗免疫保護(hù)實驗及免疫保護(hù)機理初探[A];中華醫(yī)學(xué)會第七次全國消化病學(xué)術(shù)會議論文匯編（上冊）[C];2007年

3 田要美;李惠;彭宣憲;;OmpA結(jié)構(gòu)域免疫保護(hù)功能研究[A];細(xì)胞—生命的基礎(chǔ)——中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

4 彭小紅;陳琳;Claire Gibson;Kimberly Choi;黃復(fù)生;王若冰;;藥物減毒瘧原蟲疫苗誘導(dǎo)不同時期特異的免疫保護(hù)[A];2013年全國寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

5 鄭惠;蔡方成;鐘敏;鄧兵;李欣;張曉萍;;空腸彎曲菌多價DNA疫苗的免疫保護(hù)效應(yīng)[A];中華醫(yī)學(xué)會第十四次全國兒科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2006年

6 石星明;楊桂花;趙妍;張晶;魏秀英;胡順磊;王玫;王云峰;;禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒真核表達(dá)載體的構(gòu)建及免疫保護(hù)研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

7 何光志;汪濤;;西氏貝蛔蟲Bs-Ag2抗原基因的克隆以及重組蛋白誘導(dǎo)小鼠的免疫保護(hù)試驗(英文)[A];第三屆貴州省自然科學(xué)優(yōu)秀學(xué)術(shù)論文評選獲獎?wù)撐募?010年）[C];2010年

8 朱連德;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異和疫苗免疫保護(hù)[A];中國豬業(yè)發(fā)展大會暨中國畜牧業(yè)協(xié)會豬業(yè)分會第二屆會員代表大會論文集[C];2007年

相關(guān)重要報紙文章 前3條

1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 謝青梅 李少璃;接種疫苗萬不能忽略的因素[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年

2 記者 羅臻;春季動物防疫力度大[N];黃石日報;2009年

3 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 張秀美研究員;近期禽病動態(tài)及綜合防治[N];中國畜牧報;2005年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 常志廣;瘧原蟲TatD-like DNase的功能分析及與蟲體致病性的相關(guān)性分析[D];吉林大學(xué);2016年

2 王衡;雞傳染性支氣管炎免疫增強型核酸疫苗的構(gòu)建與免疫保護(hù)機理的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 戴迎春;基于P顆粒的諾如病毒GII.4型流行株進(jìn)化機制及免疫保護(hù)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2013年

4 何光志;八種野生動物蛔蟲的分子鑒定及兩種蛔蟲抗原基因的表達(dá)與免疫保護(hù)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 胡雪鶴;胸膜肺炎放線桿菌Lip40蛋白生物學(xué)特性研究[D];華中師范大學(xué);2015年

2 湯君;豬胸膜肺炎放線桿菌tbpB基因的克隆、表達(dá)及其對小鼠的免疫保護(hù)效力研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

3 謝懷東;重組IBDV Vp2蛋白的制備與免疫保護(hù)試驗[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

4 李俊平;H5亞型禽流感DNA疫苗對鴨和鵪鶉的免疫保護(hù)效力研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

5 王平;B群鏈球菌42kD蛋白提取及其免疫學(xué)效果的初步探討[D];北京生物制品研究所;2005年

本文編號：1663757