本文選題：日本斑點(diǎn)熱立克次體　切入點(diǎn)：OmpB重組蛋白　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【研究背景】斑點(diǎn)熱群立克次體被認(rèn)為是一類分布廣、危害大由蜱傳播的人獸共患疾病。如由康氏立克次體引起的地中海斑點(diǎn)熱,由立氏立克次體引起的落基山斑點(diǎn)熱。斑點(diǎn)熱的臨床癥狀與普通的感冒相似,往往伴隨著高燒,各種疼痛,惡心和嘔吐,往往伴隨皮疹,嚴(yán)重的患者時(shí)候可能出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀。日本斑點(diǎn)熱立克次體是日本科學(xué)家1984年發(fā)現(xiàn)的。1984年,5月到7月間,日本醫(yī)生發(fā)現(xiàn)了三例患高熱和皮疹的人,且三人都住在同一個(gè)鄉(xiāng)村,在同一座山上的竹林里采集竹筍。其中兩例具有焦痂,進(jìn)行仔細(xì)觀察分析,并通過一系列的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)證明并非是恙蟲病而是一種斑點(diǎn)熱群立克次體,這種病被稱為日本斑疹熱。病原體是1985年首先從日本的四國島地區(qū)分離出來,因其作為一種新的斑點(diǎn)熱群立克次體,隨后被命名為Rickettsia japonica。2000年前,我國關(guān)于斑點(diǎn)熱立克次體研究主要在東北地區(qū),證明不同的嚙齒類動(dòng)物攜帶黑龍江斑點(diǎn)熱立克次體、西伯利亞斑點(diǎn)熱立克次體和內(nèi)蒙古斑點(diǎn)熱立克次體3種病原體,同時(shí)也從患者血液中分離到黑龍江斑點(diǎn)熱立克次體菌株。2000年后的十幾年間,我國很少有相關(guān)斑點(diǎn)熱立克次體病原學(xué)研究的報(bào)道。2013年我們團(tuán)隊(duì)在安徽省大別山區(qū)高熱、頭痛、全身斑丘疹的病人急性期血液標(biāo)本中分離到一株日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株,安徽120株(R.Japonica Anhui 120 strain),簡(jiǎn)稱安徽120株,這是首次在我國發(fā)現(xiàn)的人感染日本斑點(diǎn)熱立克次體。文獻(xiàn)報(bào)道,斑點(diǎn)熱立克次體體外培養(yǎng)在Vero細(xì)胞和L929細(xì)胞均能良好生長(zhǎng),但是我們團(tuán)隊(duì)分離到的這株菌不能在Vero和L929細(xì)胞中大量增殖,反而可在THP-1細(xì)胞(巨噬樣細(xì)胞)中大量增殖。通過對(duì)這株菌的ompA、ompB、geneD、16SrRNA、17kD基因進(jìn)行測(cè)序分析可知,OmpB基因擴(kuò)增的基因片段在3170bp和3204bp發(fā)現(xiàn)存在2個(gè)單個(gè)堿基突變,在3297~3311處與日本斑點(diǎn)熱立克次體株比較有連續(xù)15堿基的缺失。而ompb基因是日本斑點(diǎn)熱立克次體菌的外膜蛋白,與細(xì)菌結(jié)合、入侵宿主細(xì)胞有關(guān),因此我們考慮我們分離株的細(xì)胞嗜性可能與ompb基因連續(xù)15個(gè)堿基的缺失有關(guān)。因此,本文通過構(gòu)建ompb原核表達(dá)質(zhì)粒、重組蛋白表達(dá)、純化以及抗原性的相關(guān)研究方面,為立克次體致病機(jī)制研究進(jìn)行了一些基礎(chǔ)的研究�！狙芯糠椒ā�(1)日本斑點(diǎn)熱立克次體近緣株全菌多克隆抗體的制備:由本實(shí)驗(yàn)室保存的菌種去感染正常的thp-1細(xì)胞,待菌體在油鏡下用diff-quick染色觀察在細(xì)胞內(nèi)的感染率約為100%時(shí),取培養(yǎng)物去注射4只新西蘭大白兔,共注射四次,每周一次,結(jié)束后采集兔心臟血,無菌分裝后,保存于-80℃冰箱。(2)ompb重組蛋白表達(dá)與純化:將ompb基因中特殊的一段通過t4連接酶連接至pet-30a載體后,用iptg誘導(dǎo)這段ompb基因的表達(dá),利用sds-page和western-blot(wb)對(duì)重組蛋白o(hù)mpb的反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定,然后分別通過親和層析技術(shù)和變復(fù)性技術(shù)對(duì)重組蛋白o(hù)mpb上清形式和包涵體形式進(jìn)行純化。(3)間接elisa體系的建立:利用棋盤滴定法,依次確定抗原的最佳包被濃度,最佳血清稀釋濃度以及最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛?并與已有的國際上標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法(美國focus公司立克次體igg免疫熒光試劑盒,產(chǎn)品編號(hào)為:if0100mg)對(duì)比分析判斷該方法的特異性,敏感性,符合率,kappa值�！狙芯拷Y(jié)果】(1)通過免疫新西蘭大白兔,取得心臟血后無菌分裝制備成日本斑點(diǎn)熱立克次體多克隆抗體,if測(cè)得結(jié)果為強(qiáng)陽性;間接elisa方法測(cè)得兔多克隆抗體的效價(jià)為1:8000;(2)通過酶切和測(cè)序,成功的構(gòu)建含ompb基因片段的重組質(zhì)粒,純化后用lowey法測(cè)得用載體pet-30a構(gòu)建的重組蛋白濃度為4mg/ml。(3)成功的建立了ompb重組蛋白間接elisa方法的體系,并且該方法具有良好的特異性和敏感性,與與已有的國際上標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法(美國focus公司立克次體igg免疫熒光試劑盒,產(chǎn)品編號(hào)為:if0100mg)相比,兩者的符合率為99.2%。【結(jié)論】(1)質(zhì)粒高表達(dá)的OmpB重組蛋白具有很好的免疫反應(yīng)性;(2)R.Japonica Anhui 120 strain OmpB重組蛋白建立的間接ELISA方法對(duì)臨床病人血清樣本和正常人血清樣本的斑點(diǎn)熱立克次體的IgG抗體檢測(cè),有較高的敏感度和特異度。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R376.3

【參考文獻(xiàn)】

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2 郝永建;陳晨;廖遠(yuǎn)祥;高志丹;宋世佩;;斑點(diǎn)熱流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制;2015年09期

3 張驍鵬;李p橀，

本文編號(hào)：1614944