本文選題：神經(jīng)管畸形　切入點(diǎn)：NKX2.1　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:1.驗(yàn)證Nkx2.1基因在胚胎腦組織正常組和畸形組高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中的表達(dá)情況。2.通過(guò)全胚胎原位雜交技術(shù)確定Nkx2.1基因在小鼠胚胎組織中的時(shí)空表達(dá)定位。3.初步研究NKX2.1在ATRA誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形發(fā)生過(guò)程中的作用機(jī)制。方法:1.通過(guò)在C57BL/6小鼠懷孕胚胎7.5天(E7.5)時(shí),按照體重將一定劑量的全反式維甲酸(ATRA)以灌胃方式注入小鼠體內(nèi),建立小鼠胚胎神經(jīng)管畸形(NTDs)的模型;繼續(xù)飼養(yǎng)至E8.5、E9.5和E10.5時(shí)提取胚胎腦組織;2.通過(guò)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)E8.5、E9.5和E10.5腦組織中正常組和畸形組Nkx2.1 mRNA水平的表達(dá)情況,對(duì)RNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;3.通過(guò)全胚胎原位雜交技術(shù)檢測(cè)Nkx2.1在正常組和畸形組中E8.5、E9.5和E10.5的空間表達(dá)情況;4.通過(guò)使用脂質(zhì)體將化學(xué)合成的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞干擾Nkx2.1的表達(dá),將實(shí)驗(yàn)分為三組:空白對(duì)照組(未處理的正常對(duì)照組)、陰性對(duì)照組(不針對(duì)Nkx2.1序列的對(duì)照載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組)和siRNA-Nkx2.1干擾組(針對(duì)Nkx2.1干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組),采用real-time PCR和Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Nkx2.1表達(dá)結(jié)果;5.通過(guò)Cell Counting Kit-8法(CCK-8法)檢測(cè)陰性對(duì)照組和siRNA-Nkx2.1干擾組兩組細(xì)胞增殖能力的變化情況;6.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陰性對(duì)照組和sirna-nkx2.1干擾組兩組細(xì)胞周期的變化情況;7.通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)陰性對(duì)照組、sirna-nkx2.1-24h干擾組(nkx2.1干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h)和sirna-nkx2.1-48h干擾組(nkx2.1干擾載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h)三組細(xì)胞凋亡的變化情況;8.通過(guò)活化的caspase3染色法,在熒光顯微鏡下觀察陰性對(duì)照組、sirna-nkx2.1-24h干擾組和sirna-nkx2.1-48h干擾組三組細(xì)胞caspase3的激活情況;9.通過(guò)westernblotting檢測(cè)shh及其下游ptch1、smo的蛋白水平的表達(dá)變化;10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)分析采用spss17.0軟件,p0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;數(shù)據(jù)作圖使用graphpadprism5軟件。結(jié)果:1.采用21mg/kg劑量的atra灌胃,成功建立了小鼠胚胎ntds的模型。通過(guò)real-timepcr技術(shù)檢測(cè)e8.5、e9.5和e10.5腦組織中,nkx2.1在畸形組表達(dá)較正常組明顯降低,下降倍數(shù)分別約為4倍、20倍、36倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與rna測(cè)序結(jié)果一致。2.全胚胎原位雜交技術(shù)檢測(cè)nkx2.1在e8.5正常組的前腦中有微弱表達(dá),e9.5和e10.5在前腦、中腦和后腦各部位有明顯表達(dá);而在畸形組各部位幾乎均無(wú)表達(dá)。3.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染nkx2.1小干擾片段進(jìn)入neuro-2a細(xì)胞,nkx2.1在mrna和蛋白水平表達(dá)均降低。在mrna水平,空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和sirna-nkx2.1干擾組相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.09、0.93±0.05和0.35±0.03,sirna-nkx2.1干擾組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001);在蛋白質(zhì)水平,空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和sirna-nkx2.1干擾組相對(duì)表達(dá)量分別為0.76±0.02、0.66±0.12和0.31±0.02,sirna-nkx2.1干擾組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.001)。4.CCK-8法結(jié)果得出,轉(zhuǎn)染第1天和第2天,陰性對(duì)照組和siRNA-Nkx2.1干擾組兩組OD值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;轉(zhuǎn)染3天后,siRNA-Nkx2.1干擾組的OD值較陰性對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.流式結(jié)果顯示,si RNA-Nkx2.1干擾組的細(xì)胞周期中G1期細(xì)胞的比例明顯低于陰性對(duì)照組,陰性對(duì)照組和siRNA-Nkx2.1干擾組中G1期細(xì)胞的比例分別為(64.23±1.67)%和(49.31±2.51)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。6.流式結(jié)果顯示,siRNA-Nkx2.1干擾組的細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照組,且細(xì)胞凋亡隨時(shí)間延長(zhǎng)凋亡率逐漸增加;陰性對(duì)照組、siRNA-Nkx2.1-24 h干擾組和siRNA-Nkx2.1-48 h干擾組的總凋亡比例分別為(9.93±0.56)%、(12.93±0.63)%和(21.37±1.51)%,不同時(shí)間段的干擾組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.活化的Caspase3熒光染色結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,siRNA-Nkx2.1干擾組的陽(yáng)性細(xì)胞率提高,隨時(shí)間延長(zhǎng)Caspase3染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加;陰性對(duì)照組、siRNA-Nkx2.1-24 h干擾組和siRNA-Nkx2.1-48 h干擾組的Caspase3染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為5.25±1.71、16.25±3.53和27.02±2.24,不同時(shí)間段的干擾組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。8.Western blotting檢測(cè)Shh、Ptch1和Smo蛋白水平,與陰性對(duì)照組相比,siRNA-Nkx2.1干擾組中Shh、Ptch1和Smo蛋白表達(dá)水平降低,各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1.轉(zhuǎn)錄因子NKX2.1表達(dá)降低可能在ATRA誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形的發(fā)生中起重要作用。2.NKX2.1低表達(dá)可能通過(guò)參與Shh信號(hào)通路、通過(guò)影響細(xì)胞增殖降低和細(xì)胞凋亡增多而引起神經(jīng)管畸形的發(fā)生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R321

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 紀(jì)華,李澤桂,丁震宇,馬路,李紅麗,蔡文琴,常智杰,劉力,傅新元;FGF8在神經(jīng)胚形成和NTD中的表達(dá)變化及其與STAT3的關(guān)系研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2005年14期

2 趙海峰 ,肖榮;神經(jīng)管畸形的病因及細(xì)胞凋亡在發(fā)病中的作用[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2002年09期

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本文編號(hào)：1600687