本文關(guān)鍵詞： 萊姆關(guān)節(jié)炎 伯氏疏螺旋體 rBmpA THP-1 TLR 趨化因子　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[目的]以人單核巨噬細(xì)胞株(THP-1)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探究伯氏疏螺旋體重組蛋白 A(recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein A,rBmpA)刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎趨化因子風(fēng)暴是由何種Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)識(shí)別啟動(dòng)的。[方法]1、實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pGEX-6P1-bmpA重組大腸埃希菌在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),以0.1 mmol/L IPTG 37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6h,收集菌體超聲破碎,離心收集含有GST-rBmpA的上清,利用Glutathione Sepharose 4B進(jìn)行分離純化得到目標(biāo)蛋白,SDS-PAGE電泳分析。2、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,佛波酯(PMA)的作用下誘導(dǎo)成熟為巨噬細(xì)胞,用TLR1、TLR2、TLR5、TLR6的中和抗體分別處理細(xì)胞,并設(shè)立對(duì)照組,然后加入rBmpA刺激培養(yǎng)24h,在24h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,RayBiotech抗體芯片高通量檢測(cè)細(xì)胞上清中38種趨化因子的分泌量。3、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,PMA的作用下誘導(dǎo)成熟為巨噬細(xì)胞,加入rBmpA刺激培養(yǎng)20h,在0.5h、1h、5h、10h、20h的時(shí)間點(diǎn)使用Trizol試劑裂解細(xì)胞并收集細(xì)胞裂解液,通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)TLR1、TLR2、TLR5和TLR6基因的表達(dá)水平。4、6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)THP-1細(xì)胞,PMA的作用下誘導(dǎo)成熟為巨噬細(xì)胞,加入rBmpA刺激培養(yǎng)20h,在5h、10h、20h時(shí)間點(diǎn)使用RIPA裂解液裂解細(xì)胞并收集總蛋白裂解液,通過(guò)Western blotting檢測(cè)TLR1、TLR2、TLR5和TLR6蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。[結(jié)果]1、與正常對(duì)照組相比,rBmpA刺激THP-1細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞上清中,RayBiotech抗體芯片檢測(cè)的38種趨化因子中8種趨化因子分泌量增高。與rBmpA組相比,經(jīng)TLR1中和抗體處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)后上清中,5種趨化因子分泌量降低;TLR2中和抗體處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)后上清中,7種趨化因子分泌量降低;TLR5中和抗體處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)后上清中,5種趨化因子分泌量增高:TLR6中和抗體處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)后上清中,6種趨化因子分泌量增高。2、rBmpA刺激THP-1細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)1h、5h、10h后細(xì)胞中TLR1、TLR2基因表達(dá)水平增高,TLR5、TLR6的基因表達(dá)水平無(wú)變化。3、rBmpA刺激THP-1細(xì)胞培養(yǎng)5h、10h、20h后細(xì)胞總蛋白裂解液中TLR1和TLR2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平增高,TLR5、TLR6的基因表達(dá)水平無(wú)變化。[結(jié)論]1.rBmpA刺激THP-1細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致THP-1細(xì)胞的8種趨化因子分泌量增高。2.TLR1、TLR2中和抗體封閉后再用rBmpA刺激THP-1細(xì)胞,趨化因子分泌量減少。TLR5、TLR6中和抗體封閉后再用rBmpA刺激THP-1細(xì)胞,趨化因子分泌量仍增高。3.rBmpA刺激THP-1細(xì)胞后會(huì)導(dǎo)致TLR1、TLR2基因表達(dá)量和蛋白質(zhì)水平增高,TLR5、TLR6的基因表達(dá)量和蛋白質(zhì)水平均無(wú)明顯變化。4.rBmpA刺激細(xì)胞時(shí),TLR1、TLR2表達(dá)增高,同時(shí)識(shí)別BmpA并激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎趨化因子風(fēng)暴。
[Abstract]:[objective] to study human mononuclear macrophage cell line THP-1. To find out which Toll like receptor Toll-like receptor TLR was activated by recombinant Borrelia burgdorferi membrane protein AhrBmpA, a recombinant protein of Borrelia burgdorferi, which stimulates the production of pro-inflammatory chemokines in immune cells. [methods] 1Recombinant pGEX-6P1-bmpA recombinant Escherichia coli constructed in lab in LB. Expanded culture in the medium, The cells were cultured at 37 鈩，

本文編號(hào)：1544429