本文關(guān)鍵詞： 創(chuàng)傷失血 心肌細(xì)胞凋亡 Akt/Notch1/Hes1信號(hào)通路 螺內(nèi)酯 瑞舒伐他汀 厄貝沙坦　出處：《中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：嚴(yán)重創(chuàng)傷失血(traumatic hemorrhage)是直接威脅患者生命安全的危急重癥之一,常伴發(fā)全身系統(tǒng)性炎癥反應(yīng),繼而對(duì)機(jī)體重要臟器造成損害。腫瘤壞死因子是機(jī)體在受到創(chuàng)傷刺激后產(chǎn)生的一種內(nèi)源性多效調(diào)節(jié)因子,與心血管疾患的進(jìn)展緊密相關(guān),且呈明顯的雙向效應(yīng)。近年來(lái),其在凋亡以及創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用日益引發(fā)關(guān)注。Notch信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸具有決定性作用,其參與維持機(jī)體組織結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,以及損傷后的修復(fù)過(guò)程。但創(chuàng)傷失血后,其對(duì)心肌細(xì)胞能夠產(chǎn)生何種影響,目前尚不知曉。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)對(duì)創(chuàng)傷失血誘導(dǎo)大鼠心肌凋亡模型進(jìn)行研究,探討Notch1信號(hào)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,篩選能夠保護(hù)心肌免于凋亡的相關(guān)藥物,為深入了解創(chuàng)傷失血的損傷機(jī)理及治療預(yù)防研究奠定一定的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法：第一部分：創(chuàng)傷失血誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡及藥物保護(hù)機(jī)制的初步評(píng)估1、構(gòu)建急性創(chuàng)傷性失血大鼠模型,隨機(jī)分為五組(n=10),實(shí)驗(yàn)組分別給予螺內(nèi)酯、瑞舒伐他汀及厄貝沙坦干預(yù),對(duì)照組及創(chuàng)傷組正常喂養(yǎng)。2, ELISA檢測(cè)各組大鼠血清0h、1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、48h時(shí)間點(diǎn)IL-2、IL-6、 IL-10及TNF-a水平變化;取心肌組織行HE染色;WB及rt-PCR檢測(cè)心肌Bcl-2/Bax的表達(dá)、以及Akt/Notch1/Hes1通路的表達(dá)。第二部分：低濃度TNF-a激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號(hào)通路及其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制1、體外心肌細(xì)胞培養(yǎng),構(gòu)建創(chuàng)傷引發(fā)心肌凋亡模型；2、Tunel法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生;3、檢測(cè)低濃度TNF-a對(duì)心肌細(xì)胞Bcl-2/Bax與caspase-3,9的表達(dá)的調(diào)控作用,以及siRNA敲低Notch1表達(dá)后的變化;4、檢測(cè)低濃度TNF-a對(duì)心肌細(xì)胞Akt/Notch1/Hes1通路的影響,以及敲低Notch1表達(dá)后的變化;5、過(guò)表達(dá)Notch1信號(hào),檢測(cè)Bcl-2/Bax的變化。第三部分：瑞舒伐他汀、螺內(nèi)酯及厄貝沙坦在創(chuàng)傷失血導(dǎo)致心肌凋亡過(guò)程中的保護(hù)作用及比較1、體外構(gòu)建創(chuàng)傷刺激致心肌凋亡模型，檢測(cè)caspase-3,9和Bcl-2/Bax的表達(dá)以及藥物干預(yù)后的變化。2、瑞舒伐他汀、螺內(nèi)酯和厄貝沙坦干預(yù)后,分別比較各組心肌細(xì)胞caspase-3,9、Bcl-2/Bax、和Akt/Notch1/Hes1信號(hào)通路的變化,以及siRNA敲低Notch1表達(dá)后的影響。結(jié)果：第一部分：創(chuàng)傷失血誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡及藥物保護(hù)機(jī)制的初步評(píng)估1、創(chuàng)傷失血后1h時(shí),大鼠血清中TNF-a達(dá)峰值;4h時(shí)IL-6及IL-10達(dá)最高值；8h時(shí),IL-2含量最低;隨時(shí)間延長(zhǎng),IL-2、IL-6、IL-10和TNF-a均逐漸恢復(fù)至基礎(chǔ)水平;藥物干預(yù)組TNF-a水平較創(chuàng)傷組顯著升高,且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)(p0.05)。2、HE染色：創(chuàng)傷組心肌組織可見(jiàn)形態(tài)改變、腫脹和巨噬細(xì)胞聚集;藥物處理組心肌細(xì)胞體積縮小、周?chē)装Y細(xì)胞減少。3、創(chuàng)傷組大鼠心肌Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),(p0.05)：藥物干預(yù)后,Bax表達(dá)降低,Bcl-2表達(dá)升高,(p0.05)。4、藥物干預(yù)后大鼠心肌細(xì)胞中Akt/Notch1/Hesl信號(hào)通路被激活,Notch1/NICD/Hesl表達(dá)增加(p0.05)。第二部分：低濃度TNF-a激活A(yù)kt/Notch1/Hesl信號(hào)通路及其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制1、予創(chuàng)傷血清進(jìn)行心肌培養(yǎng),刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡；WB及rt-PCR檢測(cè)提示caspase-3,9增加、Bax上調(diào)/Bcl-2下調(diào)(p0.05)。2、給予低濃度TNF-a干預(yù)后,心肌凋亡減輕;caspase-3,9減少、Bax下調(diào)/Bcl-2上調(diào)(p0.05)。3、予siRNA敲低Notch1表達(dá)后,凋亡再次加重;caspase-3,9表達(dá)增加、Bax活化/Bcl-2受到抑制(p0.05)。4、WB及rt-PCR檢測(cè)提示低濃度TNF-a能夠激活A(yù)kt/Notch1/Hesl信號(hào)通路;分別給予TNF-a阻斷劑及siRNA敲低Notch1表達(dá)干預(yù)后,Akt/Notch1/Hesl信號(hào)被抑制。5、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Notch 1信號(hào)過(guò)表達(dá)后,Bax下調(diào)／Bcl-2上調(diào)。第三部分：瑞舒伐他汀、螺內(nèi)酯及厄貝沙坦在創(chuàng)傷失血導(dǎo)致心肌凋亡過(guò)程中的保護(hù)作用及比較1、Tunel實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),藥物干預(yù)均能程度不同地減輕心肌凋亡。2、瑞舒伐他汀組：經(jīng)WB及rt-PCR測(cè)定證實(shí)caspase-3,9表達(dá)下調(diào),Bax抑制/Bcl-2激活,Akt/Notch1/Hes1活化(p0.05)：敲低Notch1的表達(dá)后,呈現(xiàn)相反的表現(xiàn)(p0.05)。3、螺內(nèi)酯組：同瑞舒伐他汀組,但敲低Notch1后,caspase-9及Bcl-2的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。4、厄貝沙坦組：同瑞舒伐他汀組,但敲低Notch1的表達(dá)后,caspase-9、Bax/Bcl-2表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)差異。結(jié)論：1、創(chuàng)傷失血大鼠模型給予心肌保護(hù)藥物干預(yù)后,血清TNF-a升高且與創(chuàng)傷組相比,能長(zhǎng)時(shí)間地保持相對(duì)較高的低濃度狀態(tài)。2、低濃度]NF-α能夠激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號(hào)通路,通過(guò)Notch1通道內(nèi)源性保護(hù)作用,使心肌細(xì)胞免于創(chuàng)傷導(dǎo)致的凋亡。3、螺內(nèi)酯、瑞舒伐他汀及厄貝沙坦能夠保護(hù)細(xì)胞免于創(chuàng)傷反應(yīng)引發(fā)凋亡。瑞舒伐他汀通過(guò)上調(diào)TNF-α,激活A(yù)kt/Notch1/HeSl信號(hào)通路,調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比例以減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮保護(hù)心肌作用;螺內(nèi)酯組亦可以上調(diào)TNF-α,激活A(yù)kt/Notch1/Hes1信號(hào)通路,調(diào)整Bax表達(dá)從而發(fā)揮保護(hù)心肌作用;而厄貝沙坦拮抗凋亡的機(jī)制,并非依賴于Notch1通道。
[Abstract]:In recent years , the mechanism of apoptosis and the expression of Bcl - 2 , IL - 6 , IL - 10 and TNF - a in cardiac muscle cells were studied . Compared with the wound group , the expression of caspase - 3 , Bax and Bcl - 2 was not statistically different .

【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R641;R-332

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本文編號(hào)：1492757