本文關鍵詞： 多重耐藥鮑曼不動桿菌 gyrA 反義寡核苷酸 斑點雜交 肽核酸　出處：《第三軍醫(yī)大學學報》2013年14期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的篩選出能與多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的mRNA緊密結合的反義肽核酸序列,評估其體外抗菌活性。方法利用Mfold、RNA Structure 4.6兩種計算機軟件對多重耐藥鮑曼不動桿菌gyrA基因的mRNA進行二級結構分析計算,根據(jù)最低自由能原則在其mRNA局部雜交松弛區(qū)設計反義寡核苷酸,與體外轉錄的地高辛標記的gyrAmRNA進行斑點雜交,根據(jù)雜交信號的強弱篩選出與gyrA mRNA緊密結合的反義寡核苷酸,根據(jù)其序列合成肽核酸(pep-tide nucleic acid,PNA),另加設1條與靶序列有6個堿基錯配的PNA作為陰性對照,2條PNA分別連接穿膜肽形成肽-肽核酸(peptide-PNA,PPNA)。測定經(jīng)不同濃度PPNA處理的細菌光密度[D(600)]值并進行平板菌落計數(shù),觀察其對細菌生長的抑制作用,采用RT-PCR檢測gyrA mRNA的表達水平。結果斑點雜交結果顯示,計算機軟件設計的10條反義寡核苷酸探針中有5條與gyrA mRNA顯示出雜交信號,其中1條信號最強,能夠與gyrA mRNA穩(wěn)定結合,將其以肽-肽核酸的形式合成處理細菌,結果表明其在5μmol/L濃度可完全抑制gyrA mRNA的表達,并抑制鮑曼不動桿菌的生長,在10μmol/L濃度具有殺菌活性,而具有錯配堿基的PPNA對細菌生長無明顯抑制作用。結論計算機輔助設計聯(lián)合斑點雜交可在體外模擬體內(nèi)環(huán)境對寡核苷酸與靶基因結合的有效性進行驗證,實現(xiàn)在體外高通量篩選高效反義序列。經(jīng)篩選得到的靶向gyrA基因反義肽-肽核酸可在體外高效抑制多重耐藥鮑曼不動桿菌生長。
[Abstract]:Objective to screen the antisense peptide nucleic acid (ASN) sequence which can bind to the gyrA gene of Acinetobacter baumannii and evaluate its antibacterial activity in vitro. Methods Mfold was used. The secondary structure of gyrA gene of Acinetobacter baumannii was analyzed and calculated by two kinds of computer software RNA Structure 4.6. According to the principle of minimum free energy, antisense oligonucleotides were designed in the local hybridization relaxation region of mRNA, and dot-hybridized with digoxigenin-labeled gyrAmRNA in vitro. The antisense oligodeoxynucleotides combined with gyrA mRNA were screened according to the intensity of hybridization signal, and the peptide nucleic acid pep-tide nucleic acid was synthesized according to the sequence of antisense oligodeoxynucleotides. A PNA with 6 base mismatches was added as a negative control group, and 2 PNA were connected with peptide-PNA respectively. Determination of the optical density of bacteria treated with different concentrations of PPNA. [The expression of gyrA mRNA was detected by RT-PCR. The results of dot blot hybridization showed that the expression level of gyrA mRNA was detected by dot blot hybridization. Five of the 10 antisense oligonucleotide probes designed by computer software showed hybridization signals with gyrA mRNA, one of which had the strongest signal and could bind stably with gyrA mRNA. The results showed that it could completely inhibit the expression of gyrA mRNA and inhibit the growth of Acinetobacter baumannii at the concentration of 5 渭 mol/L. It has bactericidal activity at the concentration of 10 渭 mol/L. But PPNA with mismatched base can not inhibit the growth of bacteria. Conclusion Computer-aided design combined with dot blot can be used to verify the efficiency of oligonucleotide binding to target gene in vitro. High throughput screening of high efficiency antisense sequences was achieved in vitro. The antisense peptide-peptide nucleic acid targeting gyrA gene could effectively inhibit the growth of Acinetobacter baumannii in vitro.
【作者單位】： 重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院檢驗科;重慶市中山醫(yī)院檢驗科;
【基金】：國家自然科學基金面上項目(81071400) 重慶市自然科學基金面上項目(CSTC2010BB5343) 國家臨床重點�？平ㄔO項目經(jīng)費資助([2010]305)~~
【分類號】：R378
【正文快照】： 鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii,AB)是引起醫(yī)院感染最常見的條件致病菌之一,具有極強的環(huán)境適應能力和廣泛的耐藥性。近年來其感染率和耐藥性明顯上升,尤其是多重耐藥(multidrug-resistant,MDR)甚至泛耐藥(pan-resistant,PDR)鮑曼不動桿菌的不斷出現(xiàn),并在全球多個國家

【參考文獻】

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本文編號：1490723