本文關(guān)鍵詞： 腸道 病毒 柯薩 感染 引發(fā) microRNA 差異性 兩者 誘發(fā) 致病 機(jī)制 中的 研究　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)是一種危及5歲以下兒童健康的常見傳染病。腸道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)與柯薩奇病毒A組16型(Coxsackievirus A16,CA16)是引發(fā)HFMD的主要病原體,盡管兩者同屬于小RNA病毒科腸道屬病毒屬成員,但由兩者所誘發(fā)的HFMD相關(guān)的臨床癥狀卻有顯著性地差異。微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類長度約為22個核苷酸的非編碼小片段RNA,它可與靶基因的3'-非翻譯區(qū)相互作用后而調(diào)控靶基因的表達(dá),并廣泛參與到機(jī)體的各個生理和病理過程。目前研究表明,miRNA在病毒感染性疾病的致病過程中也具有十分重要的作用。因此,本研究擬通過 miRNA 高通量測序(High-throughput sequencing,HTS)技術(shù)探討由 EV71與CA16感染引發(fā)的差異性miRNA在兩者誘發(fā)的差異性致病機(jī)制中的研究,并對差異性的原因進(jìn)行深入的剖析,以期為EV71與CA16感染導(dǎo)致的差異性臨床癥狀及病理形成機(jī)制提供新的線索。在本研究中,EV71與CA16感染人類支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cells,16HBE)后經(jīng) miRNA HTS 分析發(fā)現(xiàn),共有 201 個 miRNA 在表達(dá)上呈現(xiàn)出兩倍差異性,其中,有65個miRNA(包括58種已知和7種新型miRNA)在EV71和CA16感染中呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢,對這些miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測后的GO與Pathway分析中表明,18個生物過程(Biological processes,BP),7個分子功能(Molecular functions,MF),1 個細(xì)胞組分(Cellular component,CC)和123個Pathway被富集,且在這些Pathway中,鈣粘蛋白信號通路,Wnt信號通路和血管生成信號通路的改變尤為明顯;在構(gòu)建的四個miRNA的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中可見miRNA在EV71與CA16感染階段發(fā)揮著復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,尤其是在細(xì)胞黏附方面,因此,這些結(jié)果表明,EV71和CA16感染誘發(fā)的差異性miRNA參與了細(xì)胞黏附的調(diào)控,這一變化可能與兩者在感染初期突破氣道上皮屏障功能相關(guān)。隨后,我們對EV71與CA16感染在16HBE上差異性進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與EV71感染相比,CA16感染可導(dǎo)致更快速的病毒增殖效率,更嚴(yán)重的細(xì)胞間通透性的破壞及更多的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,且與黏附、I-IFN產(chǎn)生及趨化因子產(chǎn)生相關(guān)的分子的表達(dá)在CA16感染中也明顯地降低;隨后,我們通過生物信息學(xué)分析找到miR-4516可能在EV71與CA16感染過程中造成的差異性細(xì)胞黏附改變有重要的作用,且Nectin1也被證實(shí)是miR-4516的靶基因;IF與WB的結(jié)果顯示,在 EV71 感染的細(xì)胞中,Nectin1、Claudin4、E-cadherin 和 ZO-1 在 16HBE細(xì)胞中的定位及蛋白質(zhì)表達(dá)的改變并不明顯,而在CA16感染的細(xì)胞中,上述蛋白在16HBE細(xì)胞中的定位及蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)顯著性地降低,但在預(yù)先給予miR-4516過表達(dá)質(zhì)粒的EV71感染細(xì)胞中,上述蛋白在16HBE細(xì)胞中的定位及蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)顯著性地降低,而預(yù)先給予miR-4516敲除質(zhì)粒的CA16感染細(xì)胞中,上述蛋白在16HBE細(xì)胞中的定位及蛋白質(zhì)表達(dá)呈現(xiàn)明顯地回升現(xiàn)象。這些結(jié)果表明,由miR-4516介導(dǎo)的差異性呼吸道上皮屏障損傷可能是導(dǎo)致EV71和CA16感染不同結(jié)局的開始。繼而,我們對EV71與CA16感染恒河猴PBMC后也進(jìn)行了 miRNA HTS分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),共有119個miRNA在表達(dá)上呈現(xiàn)出經(jīng)兩倍差異性,其中,僅有32個已知miRNA在EV71和CA16感染中呈現(xiàn)相反的表達(dá)趨勢,對這些miRNA的靶向基因進(jìn)行GO與Pathway的分析中表明,有14個BP,10個MF,8個CC和104個Pathway被富集;在構(gòu)建的四個miRNA的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中可見miRNA在EV71與CA16感染階段顯示出復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制,尤其是在免疫反應(yīng)方面。這些結(jié)果說明,在EV71與CA16感染過程中誘發(fā)的差異性miRNA可能通過調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)而直接參與到差異性臨床免疫癥狀的形成。最后,我們對EV71與CA16感染恒河猴CD1c+樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)后的免疫反應(yīng)進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn),EV71感染CD1c+DC后I-IFN產(chǎn)生顯著性下降,病毒載量、病毒滴度與病毒感染量上升,Th2與Tfh相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子表達(dá)顯著性上升;而CA16感染CD1c+DC后I-IFN產(chǎn)生顯著性上升,病毒載量、病毒滴度與病毒感染量下降,Th1與Treg相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞因子表達(dá)顯著性上升。這些結(jié)果說明,EV71與CA16感染恒河猴CD1c+DC后可能會造成固有免疫反應(yīng)與適應(yīng)性免疫反應(yīng)顯著性地差異,這些差異可能與兩者誘發(fā)的差異性臨床癥狀及病理形成相關(guān)。因此,上述結(jié)果說明,由EV71與CA16感染引發(fā)的差異性miRNA在兩者誘發(fā)的差異性致病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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本文編號：1471153