本文關鍵詞： 鞭毛蛋白 重組鼠疫抗原 鼠疫炭疽聯(lián)合疫苗 F1抗原表位　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：鼠疫和炭疽均屬于自然疫源性烈性傳染病,嚴重威脅著人類的健康安全。這兩類疾病的病原體鼠疫耶爾森氏菌和炭疽芽胞桿菌均被美國列為反恐重點病原體,最高優(yōu)先級A類病原體。此外,我國存在大范圍的鼠疫和炭疽的高發(fā)地,近年來國內鼠疫、炭疽疫情時有發(fā)生。不論平時、戰(zhàn)時我國都有同時面對鼠疫和炭疽威脅的風險。因此,對鼠疫和炭疽疫苗的研究兼顧軍用與民用,具有重要意義。尤其是近年來,抗生素的大量使用導致耐藥菌株出現(xiàn)后,使得對鼠疫和炭疽的預防顯得更加重要。本研究利用鞭毛蛋白作為疫苗的佐劑,以鼠疫耶爾森氏菌的保護性抗原F1和V,以及位于炭疽芽胞桿菌保護性抗原PA結構域2的中和性表位2β2-2β3loop區(qū)作為疫苗的有效成分來研究鼠疫炭疽聯(lián)合疫苗的可行性。鞭毛蛋白是一種Toll樣受體5(TLR5)的配體,通過刺激細胞因子的產生和樹突細胞的成熟而將先天性免疫和適應性免疫聯(lián)系起來而發(fā)揮佐劑功能,完整的鞭毛蛋白或其片段均可作為佐劑,包括作為黏膜佐劑,基于鞭毛蛋白佐劑的疫苗僅需較低劑量即可激起有效的免疫反應,而且在老齡免疫系統(tǒng)中鞭毛蛋白仍具有佐劑活性。鑒于鞭毛蛋白作為疫苗佐劑的一系列優(yōu)勢,構建基于鞭毛蛋白佐劑的重組鼠疫抗原、炭疽表位重組蛋白和鼠疫炭疽重組融合蛋白。在評價重組鼠疫抗原和炭疽表位重組蛋白的基礎上,初步探討鼠疫炭疽聯(lián)合疫苗的免疫反應機制,同時評價鞭毛蛋白作為疫苗佐劑的效果。本研究首先通過基因重組對F1抗原進行了突變,得到了F1mut突變體,該突變體中F1單體形成的凹槽可以封閉自身的N端,形成分子內互補,使得F1以單體形式存在,不易發(fā)生聚集。在F1mut的C端融合V抗原,將構建好的F1mut-V克隆至缺失了186-397位氨基酸的鞭毛蛋白的185位氨基酸的C端,得到Fli Cdel-F1mut-V重組鼠疫抗原。通過Western blotting驗證重組鼠疫抗原的成功表達以及與F1和V單抗的結合能力。在小鼠模型上進行了免疫原性和免疫保護評價。免疫小鼠的血清學檢測結果顯示Fli Cdel-F1mut-V在小鼠體內誘導高效價的抗F1和抗V的特異性抗體;攻毒實驗結果顯示以鞭毛蛋白為佐劑的重組鼠疫抗原Fli Cdel-F1mut-V免疫小鼠后,完全保護小鼠抵抗104 CFU鼠疫標準強毒株141株的攻擊。在對抗生物恐怖時,往往需要同時應對多種烈性病原體。研制多種烈性病原體的聯(lián)合疫苗能夠同時預防兩種或兩種以上的疾病,大大減少免疫次數(shù),節(jié)省衛(wèi)生資源。此外,聯(lián)合疫苗的應用不論在戰(zhàn)時還是平時都可以增加接種者,特別是兒童的依從性。本研究開展了基于鞭毛蛋白佐劑的鼠疫炭疽聯(lián)合疫苗的探索研究。實驗室前期的工作證明了2β2-2β3loop區(qū)為炭疽保護性抗原PA重要的中和性表位區(qū)域。本研究構建了基于鞭毛蛋白佐劑的鼠疫炭疽重組融合蛋白Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2及炭疽表位重組蛋白Fli Cdel-PAloop2。通過Western blotting驗證Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2的成功表達,通過Dot blotting和ELISA鑒定Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2與PA結構域2特異性單抗的結合能力。在免疫大鼠的血清學檢測中,Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2均誘導產生PA的特異性抗體,但抗體水平較r PA誘導的抗體水平低;而Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2組誘導產生的PA特異性抗體整體低于Fli Cdel-PAloop2組,這可能與2β2-2β3loop區(qū)在重組蛋白折疊過程中其功能區(qū)被遮蓋,使得誘導機體產生抗體的能力下降所致,也可能是Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2各組分之間會因物理化學性質的不同而產生影響。大鼠模型上使用氫氧化鋁佐劑的Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2與未使用佐劑Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2刺激產生的PA特異性抗體水平之間無顯著性差異,而其中無佐劑的Fli Cdel-PAloop2誘導產生的PA特異性抗體水平僅次于r PA免疫組,提示Fli Cdel本身就是一種良好的佐劑。在小鼠模型上檢測到Fli Cdel-PAloop2和Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2能夠誘導產生PA中和抗體,但中和抗體的水平低于r PA免疫組,而且產生中和抗體的小鼠在注射炭疽毒素后生存時間得到延長。這提示僅依靠PA結構域2的2β2-2β3loop一個表位,代替完整PA是不夠的,還需要其他中和性表位的同時存在。另外,在小鼠模型上,Fli Cdel-F1mut-V-PAloop2的免疫血清中檢測出較高水平的F1和V特異性抗體。為了避免在聯(lián)合疫苗中大分子蛋白在結構上對小分子蛋白或者表位的遮蓋,從而影響各組分的效力,應用抗原的中和性表位代替完整抗原就可以促進聯(lián)合疫苗的合理設計。本研究利用鼠疫菌F1抗原的中和性單克隆抗體F2H5對噬菌體展示隨機12肽庫進行了篩選,得到兩株能與F1抗原競爭結合F2H5抗體的噬菌體單克隆,其肽序列為:FIPEVRDPRYHP和MTLDLPDLRYGF。然而這兩個肽序列與F1抗原經(jīng)序列比對,并無一致性序列存在。此后,將篩選到的肽序列與Fli Cdel通過基因重組,得到重組蛋白Fli Cdel-F1候選表位。重組蛋白在Western blotting分析和ELISA分析結果中,均顯示可以被F1單克隆抗體識別,認為篩選到的肽序列為F2H5的模擬表位。F1表位的研究還只是的初步探索,其有效性尚需大量實驗進一步驗證。綜上所述,本研究應用了一個良好的疫苗佐劑Fli Cdel,構建了基于鞭毛蛋白的重組鼠疫抗原Fli Cdel-F1mut-V,在小鼠模型上證實了Fli Cdel-F1mut-V良好的免疫保護性,該重組鼠疫抗原具有良好的應用前景。此外,構建了基于鞭毛蛋白的炭疽表位重組蛋白Fli Cdel-PAloop2和鼠疫炭疽聯(lián)合疫苗Fli Cdel-F1mut-VPAloop2,在大鼠和小鼠模型上分別誘導產生了體液免疫反應,延長了炭疽毒素攻擊小鼠的存活時間;在大鼠模型上證實了鞭毛蛋白的佐劑作用。此外,還篩選到了兩個F1抗原的模擬表位,為研究鼠疫表位疫苗打下了一定基礎。
[Abstract]:In this study , we study the feasibility of using flagellin as adjuvant of vaccine adjuvant , and it is very important to study the immune response mechanism of plague and anthrax . Fli Cdel - PAloop2 and Fli Cdel - F1mut - V - PAloop2 were induced to produce PA neutralizing antibodies . In addition , the mimic epitope of two F1 antigens has been screened , which lays a foundation for the study of plague epitope vaccines .

【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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