本文關鍵詞： 缺血性腦卒中 自由基 氧化損傷 藥效學研究 神經(jīng)修復 細胞凋亡　出處：《暨南大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的參照CFDA、FDA和STAIR有關腦卒中藥物藥效學研究相關技術指導原則,在SD大鼠永久性缺血腦卒中模型、缺血再灌注腦卒中模型以及全腦缺血腦卒中模型中系統(tǒng)規(guī)范的研究TBN的藥效學作用,并在永久性缺血腦卒中模型中對TBN的保護作用機理進行深入研究,為TBN進入臨床試驗提供實驗基礎;同時,通過完成TBN藥效學研究,在本實驗室建立起系統(tǒng)規(guī)范的腦卒中藥物臨床前藥效學研究體系,用于其它腦卒中藥物的藥效學研究。方法1.應用激光多普勒血流儀監(jiān)測SD大鼠損傷側大腦中動脈供血區(qū)血流量變化,建立永久性缺血腦卒中模型,結合實驗過程中大鼠體重、體溫、血氣等生理指標的監(jiān)測,以Neurological severity score行為學變化和腦梗死面積為主要觀察指標,系統(tǒng)的研究TBN在永久性缺血腦卒中模型中的量效關系、治療時間窗、藥效學作用以及不同給藥方式的藥效學作用。2.應用線栓法栓塞大鼠大腦中動脈,建立缺血再灌注腦卒中模型,術后靜脈推注給予受試化合物TBN,聯(lián)合實驗過程中腦血流量、血氣、心率、血壓、體重、體溫等生理參數(shù)的監(jiān)測,以大鼠Rotarod、Longa以及Neurological severity score三種行為學指標和腦梗死面積為主要指標,研究TBN在缺血再灌注腦卒中大鼠中的藥效學作用;3.通過結扎SD大鼠雙側頸總動脈,建立全腦缺血腦卒中模型,術后7天一天2次靜脈注射給予30 mg/kg的受試化合物TBN,以Y迷宮、新物體識別、步態(tài)分析主要指標,聯(lián)合腦血流量、血氣、體重、體溫等生理參數(shù)的監(jiān)測,研究TBN在全腦缺血腦卒中大鼠中的長期藥效學作用;4.應用HE染色、免疫組化、Western blot等技術,探討TBN保護缺血腦卒中損傷的可能作用機理,為闡明TBN的藥效學提供理論基礎。結果1.在sd永久性缺血腦卒中大鼠模型中,實驗前和實驗結束時稱量記錄大鼠體重,各組之間大鼠體重在術后均顯著降低,但組間未見統(tǒng)計學差異,說明在該實驗中tbn對永久缺血性腦卒中大鼠的體重沒有影響。實驗采用neurologicalseverityscore法分別在大腦中動脈栓塞后3h和24h對各組大鼠進行行為學評價,實驗結果顯示:tbn可以有效的改善缺血大鼠的行為、感覺、平衡、反射功能;缺血24h后,腦組織切片染色可見10mg/kg的tbn、30mg/kg的tbn、90mg/kg的tbn均能顯著減小大鼠的腦梗死面積,保護率分別為16.64%、14.50%和22.82%。在tbn量效關系研究中,tbn最低起效劑量為10mg/kg。在tbn治療時間窗研究中,tbn治療時間窗可達6h。在tbn給藥方式研究中,tbn靜脈連續(xù)給藥藥效學作用優(yōu)于tbn靜脈推注給藥藥效學作用。2.在sd大鼠缺血再灌注腦卒中模型中,實驗采用rotarod法、longa法以及neurologicalseverityscore三種方法分別對各組大鼠進行行為學評價。rotarod法結果顯示,10mg/kg的tbn和90mg/kg的tbn在實驗第9天時均可以顯著的提高缺血大鼠在轉棒上的滯留時間,其中90mg/kg的tbn治療作用與edaravone效能相近,而川芎嗪無明顯改善作用;longa法結果顯示,30mg/kg的tbn和90mg/kg的tbn可以有效的改善缺血大鼠行為學缺失癥狀;neurologicalseverityscore法證明10、30、90mg/kg的tbn在實驗第9天可以有效的綜合改善缺血大鼠的行為、感覺、平衡、反射功能,其中90mg/kg的tbn從實驗第3天開始就能顯著改善腦卒中動物neurologicalseverityscore。腦梗死染色可見低、中、高劑量的tbn均能顯著減小大鼠的腦梗死體積,其保護率分別為21.7%、31.3%、36.3%。10mg/kg的tbn保護作用與85mg/kg的tmp·hcl保護作用相當(與90mg/kg等摩爾濃度),90mg/kg的tbn保護作用和edaravone6mg/kg保護作用相當,但edaravone6mg/kg劑量是臨床使用劑量的13倍。3.在全腦缺血腦卒中模型中,tbn給藥一周后,實驗采用y迷宮、新物體識別、步態(tài)分析對大鼠的學習記憶以及運動功能進行評價,實驗連續(xù)觀察6周。結果可見,無論是在y迷宮實驗中,還是在新物體實驗中,tbn均能提高全腦缺血腦卒中大鼠的學習記憶能力,藥效與臨床一線用藥Memantine藥效相當;而在步態(tài)分析中,模型組大鼠與假手術組大鼠相比,未見統(tǒng)計學差異,TBN組與模型組相比也未見統(tǒng)計學差異;在病理學研究中,TBN可以顯著的增加全腦缺血腦卒中大鼠神經(jīng)元細胞數(shù)目,并能保護神經(jīng)纖維的損傷。4.TBN作用機理研究結果可見,在缺血24 h永久性缺血腦卒中模型中,90 mg/kg的TBN可以顯著的降低腦卒中大鼠氧化損傷指標4-HNE和8-OHd G的表達,增加永久性缺血腦卒中大鼠半影區(qū)神經(jīng)細胞數(shù)目,降低神經(jīng)膠質細胞數(shù)目。Western blot結果顯示TBN可以通過上調p-Akt通路,從而上調Bcl-2、下調Bax、抑制Cyt C釋放、降低Caspase-3和cleaved caspase-3蛋白的表達,從而抑制神經(jīng)細胞凋亡;TBN可以上調PSDS95、CNPase、MEF2C蛋白的表達,降低腦卒中大鼠神經(jīng)細胞軸突和突觸的損傷;TBN還可以通過促進VEGF和MEF2C蛋白的表達,保護半影區(qū)腦實質內的微小血管。在正常大鼠皮層神經(jīng)細胞線粒體實驗中,TBN可以降低抗霉素A誘導的線粒體內自由基的產(chǎn)生以及自由基對線粒體膜脂質氧化損傷,并能顯著抑制CaCl2誘導的線粒體腫脹。結論1.TBN在永久性缺血腦卒中大鼠、缺血再灌注腦卒中大鼠、全腦缺血腦卒中大鼠中均能顯著的改善神經(jīng)行為學功能缺損,并能顯著降低腦梗死面積或保護神經(jīng)原細胞損傷,其藥效優(yōu)于臨床上使用的依達拉奉和川芎嗪。TBN最低起效劑量為10 mg/kg,治療時間窗為6 h。2.TBN可以清除線粒體內自由基和抑制線粒體內鈣超載,并且可通過調控線粒體凋亡通路和MEF2C通路抑制細胞凋亡,保護神經(jīng)細胞損傷;TBN通過上調PSDS95、CNPase、MEF2C蛋白表達,降低腦卒中大鼠神經(jīng)細胞軸突和突觸的損傷;TBN通過上調VEGF和MEF2C蛋白表達,保護缺血腦卒中半影區(qū)腦實質內微小穿支血管。
[Abstract]:Objective To study the pharmacodynamic effects of TBN in cerebral artery of SD rats and to establish a permanent ischemic stroke model . The experimental results showed that tbn of 10 mg / kg and tbn of 90 mg / kg could significantly improve the cerebral infarction area in rats . Conclusion 1 . TBN can significantly improve neurobehavioral deficits in rats with cerebral ischemic stroke , ischemia - reperfusion stroke rats and whole cerebral ischemic stroke .

【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285.5;R-332
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本文編號：1449625