本文關(guān)鍵詞：長(zhǎng)非編碼RNA TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控及其在血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥中的作用機(jī)制研究　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景和研究目的基因組序列分析的結(jié)果表明在人類基因組中只有不到2%的基因能翻譯成蛋白質(zhì),而其余98%左右的基因都是轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA。其中,長(zhǎng)非編碼RNA (long noncoding RNA, lncRNA)的功能和作用機(jī)制倍受關(guān)注。LncRNA是長(zhǎng)度上大于200個(gè)堿基的非編碼RNA,在哺乳動(dòng)物中占轉(zhuǎn)錄本的4%—9%。目前的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控,表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié),干細(xì)胞分化等多種生物學(xué)過程中都發(fā)揮著重要作用。在之前的研究中,我們利用新型丁內(nèi)酯衍生物3-芐基-5-(2-硝基苯氧甲基)-γ-丁內(nèi)酯(3BDO)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來源于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2 (TGFB2) 3'UTR的lncRNA, TGFB2-OT1。由于TGFB2-OT1位置的特殊性,利用傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法無法特異性地阻斷其表達(dá)。我們先前的研究結(jié)果表明,3BDO可以通過促進(jìn)T細(xì)胞限制性胞內(nèi)抗原-1(TIA1)的磷酸化抑制TGF2-OT1的產(chǎn)生,表明TIA1是參與調(diào)控TGFB2-OT1表達(dá)的重要因子,而3BDO是研究TGFB2-OT1功能的有力工具。另外,3BDO能夠抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子1(NUPR1)的上調(diào)及其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。NUPR1是重要的轉(zhuǎn)錄因子,因此,我們推斷NUPR1可能參與TIA1的表達(dá)調(diào)控,進(jìn)一步影響TGFB2-OT1的產(chǎn)生。在本論文中,我們擬證明該推斷。鑒于TIA1的磷酸化程度是控制TGF2-OT1產(chǎn)生的關(guān)鍵,因此,尋找能夠直接影響TIA1磷酸化的因子是調(diào)控TGF2-OT1表達(dá)的另一思路,目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠抑制TIA1磷酸化的因子。在本論文中,我們擬解決這一重要問題。先前,利用酵母雙雜交和免疫共沉淀的方法,我們發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A7(ANXA7)能與TIA1相互作用。同時(shí),進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中苯并嗯嗪衍生物2,3-二氫-3-羥甲基-6-氨基-1,4-苯并VA嗪(ABO)能夠靶向ANXA7,抑制ANXA7的GTPase活性,以及其相互作用蛋白的磷酸化,因此,我們推斷ANXA7可能是影響TIA1磷酸化的重要因子。在本研究中,我們擬以化學(xué)小分子3BDO和ABO為工具,證明我們的推斷。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cells, VECs)在機(jī)體內(nèi)可直接與血液接觸,是心血管封閉系統(tǒng)的形態(tài)基礎(chǔ)。內(nèi)皮細(xì)胞功能的異常與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),而炎性因子的刺激往往會(huì)引起內(nèi)皮的功能紊亂。例如,在炎性因子的刺激下,內(nèi)皮會(huì)發(fā)生活化,引起炎性細(xì)胞水平增加,并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生和發(fā)展。因此,發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新因子對(duì)于心血管疾病的治療具有重要的意義。在血管內(nèi)皮生物學(xué)中,對(duì)于lncRNA的研究才剛剛開始,并且目前關(guān)于lncRNA在炎癥中的研究主要集中在其它的細(xì)胞類型中,例如巨噬細(xì)胞。因此,對(duì)于lncRNA在介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用還未搞清。我們之前的研究結(jié)果表明,TGFB2-OT1能夠作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA (Competing endogenous RNA, ceRNA),結(jié)合MIR4459,通過上調(diào)ATG13的表達(dá)來促進(jìn)自噬。而在體內(nèi)外3BDO的處理均能夠抑制炎性誘導(dǎo)因子氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)引起的炎性因子的產(chǎn)生。自噬和炎癥是兩個(gè)關(guān)系十分密切的生物學(xué)過程。自噬會(huì)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),而炎癥相關(guān)因子會(huì)影響自噬。因此,我們推測(cè)TGFB2-OT1可能參與炎癥反應(yīng)。在本論文中,為了證明該推斷,我們深入研究了TGFB2-OT1在內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)中的作用及其分子機(jī)制。綜上所述,本論文旨在研究lncRNA TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)功能,以生物活性的化學(xué)小分子為工具,研究TGFB2-OT1在內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥中的表達(dá)調(diào)控及其作用機(jī)制,鑒定出參與此過程的新的關(guān)鍵因子和信號(hào)通路,為治療心血管疾病提供新的靶點(diǎn)和有效工具。研究?jī)?nèi)容1.研究NUPR1和TIA1對(duì)TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制。2.研究TIA1與ANXA7的相互作用及其調(diào)控TGFB2-OT1表達(dá)的機(jī)制。3.研究TGFB2-OT1在血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)中的作用。4.研究TGFB2-OT1調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞自噬和炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制。研究方法1.本論文是以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人胚腎細(xì)胞(HEK293細(xì)胞)為細(xì)胞模型,以apoE-/-小鼠為動(dòng)物模型,以化學(xué)小分子ABO和3BDO為工具,進(jìn)行相關(guān)研究。2.檢測(cè)NUPR1和TIA1對(duì)TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控：2.1利用原位雜交和熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,有無3BDO存在時(shí),LPS對(duì)TGFB2-OT1表達(dá)水平的影響。2.2利用Western blot檢測(cè)LPS對(duì)TIA1蛋白水平的影響,以及oxLDL對(duì)NUPR1和TIA1蛋白水平的影響。2.3利用RNA干擾技術(shù),Western blot以及熒光定量PCR方法檢測(cè)NUPR1和TIA1在調(diào)控TGFB2-OT1表達(dá)中的上下游關(guān)系。3.檢測(cè)ANXA7和TIA1的相互作用及其調(diào)控方式：3.1 以時(shí)間依賴的方式用ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,提取蛋白,利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)ABO對(duì)TIA1和ANXA7相互作用的影響。3.2以時(shí)間依賴的方式用ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,以TIA1 siRNA處理組來確定磷酸化條帶的特異性,免疫沉淀檢測(cè)ABO對(duì)TIA1磷酸化水平的影響。3.3用ANXA7 siRNA下調(diào)ANXA7的表達(dá)后,再用ABO處理,免疫沉淀檢測(cè)ANXA7對(duì)TIA1磷酸化水平的影響。4.檢測(cè)ANXA7和TIA1對(duì)TGFB2-OT1的表達(dá)調(diào)控：4.1利用半定量PCR技術(shù)檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ABO處理對(duì)TGFB2-OT1水平的影響。4.2利用Western blot檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ABO處理對(duì)ATG13蛋白水平的影響。4.3利用RNA干擾技術(shù),Western blot以及免疫熒光檢測(cè)下調(diào)TIA1的表達(dá)后,ABO誘導(dǎo)的自噬水平變化。4.4在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,用3BDO和ABO共同處理,利用Western blot免疫熒光檢測(cè)LC3-Ⅱ的蛋白水平和在細(xì)胞中的分布,以明確自噬水平的變化。5. ANXA7和TIA1作用機(jī)制的體內(nèi)驗(yàn)證：5.1用高脂飼料喂養(yǎng)apoE-/-小鼠,建立動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型,腹腔注射ABO(50 mg/kg/day)和等劑量的DMSO。5.2取胸主動(dòng)脈,進(jìn)行冰凍組織切片,以CD31作為內(nèi)皮層的標(biāo)記,利用免疫熒光雙染色的方法檢測(cè)內(nèi)皮層上ANXA7和TIA1相互作用的變化。5.3在冰凍組織切片上,以CD31作為內(nèi)皮層的標(biāo)記,利用免疫熒光染色的方法檢測(cè)內(nèi)皮層上ATG13的水平變化。6.能夠與TGFB2-OT1結(jié)合的新的microRNA的鑒定：6.1利用microRNA芯片尋找受到TGFB2-OT1調(diào)控的microRNA。6.2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)能夠與TGFB2-OT1結(jié)合的microRNA。6.3結(jié)合microRNA芯片和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果,選擇合適的microRNA,利用熒光定量PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證。6.4構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體,將TGFB2-OT1野生型cDNA以及分別突變與MIR3960和MIR4488結(jié)合位點(diǎn)的TGFB2-OT1突變型cDNA克隆到熒光素酶報(bào)告基因下。將野生型以及突變型熒光素酶報(bào)告基因載體分別與MIR3960和MIR4488 mimics共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。利用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的活性,證明MIR3960和MIR4488能夠與TGFB2-OT1直接結(jié)合。7.MIR3960和MIR4488靶點(diǎn)的驗(yàn)證：7.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MIR3960和MIR4488的靶基因。7.2利用MIR3960和MIR4488的mimics和inhibitor,研究其對(duì)靶基因mRNA和蛋白水平的影響。7.3將CERS1和NAT8L的3'UTR分別克隆到熒光素酶報(bào)告基因下,與MIR3960和MIR4488 mimics分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。利用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶的活性,驗(yàn)證MIR3960和MIR4488與靶基因CERS1和NAT8L的直接結(jié)合。7.4利用Western blot和過表達(dá)技術(shù),檢測(cè)TGFB2-OT1對(duì)靶基因CERS1和NAT8L的影響。8.MIR4459的靶基因LARP1在內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中的作用檢測(cè)：8.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,利用MIR4459 mimics轉(zhuǎn)染檢測(cè)LAPR1水平的變化。8.2利用Western blot和過表達(dá)技術(shù),檢測(cè)TGFB2-OT1對(duì)LAPR1水平的影響。8.3檢測(cè)MIR4459 mimics轉(zhuǎn)染對(duì)SQSTM1水平的影響。8.4利用過表達(dá)技術(shù),Western blot以及熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)TGFB2-OT1對(duì)SQSTM1下游因子半胱氨酸蛋白酶1(Caspase 1)切割及白介素1β(IL1B)水平的影響。9.陰性對(duì)照載體lncRNA AF007131在炎癥反應(yīng)中作用的檢測(cè)：9.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,利用過表達(dá)技術(shù),Western blot以及免疫熒光方法檢測(cè)AF007131對(duì)SQSTM1水平和分布的影響。9.2利用過表達(dá)技術(shù)和免疫熒光方法檢測(cè)AF007131對(duì)NFKB RELA亞基在血管內(nèi)皮細(xì)胞中分布情況的影響。研究結(jié)果1. NUPR1通過促進(jìn)TIA1的蛋白水平上調(diào)TGFB2-OT1的表達(dá)。1.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,原位雜交以及熒光定量PCR結(jié)果顯示,LPS處理以時(shí)間和劑量依賴的方式上調(diào)TGFB2-OT1的水平,而用3BDO同時(shí)處理時(shí),會(huì)抑制TGFB2-OT1水平的上調(diào)。1.2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,LPS和oxLDL的處理均會(huì)上調(diào)NUPR1和TIA1的蛋白水平,而3BDO會(huì)抑制NUPR1和TIA1蛋白水平的上調(diào)。1.3在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,干擾掉NUPR1或TIAl的表達(dá)后,LPS就不能誘導(dǎo)TGFB2-OT1水平的上調(diào)。1.4在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,干擾掉NUPR1的表達(dá)后,LPS就不能引起TIA1蛋白水平的上調(diào)。2.ABO促進(jìn)TIA1和ANXA7的相互作用,抑制TIA1的磷酸化。2.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,用ABO處理2h和3h會(huì)明顯促進(jìn)ANXA7和TIA1的相互作用。2.2 ABO處理血管內(nèi)皮細(xì)胞3 h,會(huì)明顯抑制TIA1絲氨酸位點(diǎn)的磷酸化水平,干擾掉ANXA7的表達(dá)后,ABO對(duì)TIA1磷酸化水平的影響被抑制。2.3在干擾掉TIA1的表達(dá)后,ABO就不能上調(diào)LC3-II的蛋白水平及其在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的點(diǎn)狀聚集,也不能下調(diào)SQSTM1的水平,表明TIA1通過與ANXA7相互作用參與到ABO誘導(dǎo)的自噬過程中。3. ANXA7和TIA1的相互作用促進(jìn)TGFB2-OT1的產(chǎn)生。3.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,ABO處理12 h和24 h會(huì)上調(diào)TGFB2-OT1和ATG13的水平。3.2用3BDO和ABO共同處理血管內(nèi)皮細(xì)胞,會(huì)明顯抑制ABO誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ蛋白水平的上調(diào)以及在細(xì)胞中的點(diǎn)狀聚集。4.在apoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層上,ABO能夠上調(diào)ANXA7和TIA1的相互作用,促進(jìn)ATG13的表達(dá)。4.1利用免疫熒光雙染方法,發(fā)現(xiàn)ABO處理明顯上調(diào)ANXA7和TIA1在主動(dòng)脈內(nèi)皮層上的共定位。4.2 ABO處理組,小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮層上ATG13的蛋白水平也有明顯提高。5. TGBFB2-OT1能夠直接結(jié)合MIR3960和MIR4488。5.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,用3BDO處理下調(diào)TGFB2-OT1的表達(dá),或者是用pCMV6-TGFB2-OT1載體轉(zhuǎn)染上調(diào)TGFB2-OT1的表達(dá)后,分別進(jìn)行microRNA芯片檢測(cè)。同時(shí)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)能夠與TGFB2-OT1結(jié)合的microRNA。綜合二者結(jié)果進(jìn)行分析,找到五個(gè)潛在microRNA。通過表達(dá)豐度以及靶基因情況的篩選,確定進(jìn)一步研究對(duì)象為MIR3960和MIR4488。5.2對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。血管內(nèi)皮細(xì)胞中3BDO處理會(huì)明顯上調(diào)MIR3960和MIR4488的水平,而TGFB2-OT1的過表達(dá)會(huì)抑制MIR3960和MIR4488的水平。5.3熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,MIR3960 mimics會(huì)導(dǎo)致Luci-TGFB2-OT1的活性有60%的下調(diào),MIR4488 mimics會(huì)導(dǎo)致Luci-TGFB2-OT1的活性有40%的下調(diào)。在突變了與TGFB2-OT1的結(jié)合位點(diǎn)后,MIR3960和MIR4488 mimics均不能影響熒光素酶的活性。6. TGFB2-OT1通過結(jié)合MIR3960和MIR4488,調(diào)控靶蛋白CERS1和NAT8L的水平。6.1用MIR3960和MIR4488的mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,MIR3960和MIR4488的mimics可以分別下調(diào)CERS1和NAT8L的mRNA和蛋白水平。與此相反,MIR3960和MIR4488的inhibitor會(huì)明顯上調(diào)CERS1和NAT8L的mRNA和蛋白水平。6.2分別將CERS1和NAT8L的3'UTR克隆到熒光素酶報(bào)告基因下,然后分別與MIR3960和MIR4488 mimics共同轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。結(jié)果表明,MIR3960 mimics會(huì)明顯降低Luc-CERS1-3'UTR的熒光素酶活性,而MIR4488 mimics會(huì)明顯降低Luc-NAT8L-3'UTR的熒光素酶活性。6.3在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,用3BDO處理下調(diào)TGFB2-OT1的表達(dá)會(huì)明顯抑制CERS1和NAT8L的mRNA和蛋白水平,而在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)TGFB2-OT1會(huì)促進(jìn)CERS1和NAT8L的蛋白水平。7. TGFB2-OT1通過MIR4459和LARP1調(diào)控蛋白合成和炎性反應(yīng)。7.1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,MIR4459 mimics的轉(zhuǎn)染會(huì)下調(diào)LAPR1和SQSTM1的蛋白水平。7.2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,用3BDO處理下調(diào)TGFB2-OT1的表達(dá)會(huì)明顯抑制LARP1的mRNA和蛋白水平,而在HEK293細(xì)胞中過表達(dá)TGFB2-OT1會(huì)促進(jìn)LARP1的蛋白水平。7.3 TGFB2-OT1的過表達(dá)會(huì)促進(jìn)促進(jìn)切割的Caspase 1水平和IL1B的mRNA水平,而3BDO處理會(huì)抑制IL1B的mRNA水平的上調(diào)。結(jié)論1.在炎性誘導(dǎo)因子LPS和oxLDL的作用下,NUPR1通過上調(diào)TIA1的蛋白水平來促進(jìn)TGFB2-OT1的產(chǎn)生,表明NUPR1和TIA1參與調(diào)控TGFB2-OT1的表達(dá)。2. ANXA7通過與TIA1的相互作用,抑制TIA1的磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)TGFB2-OT1的表達(dá),表明ANXA7通過調(diào)控TIA1的磷酸化,與TIA1共同參與TGFB2-OT1表達(dá)調(diào)控。3. TGFB2-OT1作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA,通過結(jié)合MIR3960和MIR4488,上調(diào)靶基因CERS1和NAT8L的水平,促進(jìn)自噬。4. TGFB2-OT1通過結(jié)合MIR4459,上調(diào)靶基因LARP1的水平,通過SQSTM1提高切割的CASP1以及IL1B的水平,促進(jìn)炎癥。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R3416;Q78
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本文編號(hào)：1432995