發(fā)布時間：2018-01-16 08:03

  本文關(guān)鍵詞：蚊傳播腦脊髓炎病毒多重PCR-芯片實驗室集成檢測系統(tǒng)研究　出處：《重慶大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：蚊傳播腦炎病毒是一類感染對象廣泛危害嚴(yán)重的蟲媒病毒,其易感動物包括鳥、豬、馬,嚙齒動物和人類。東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒、拉科魯尼亞病毒、辛德畢斯病毒、日本腦炎病毒、圣劉易斯腦炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亞熱、登革熱病毒等均在特定的地理區(qū)域危害公共衛(wèi)生安全。該類病原的相同特征均是通過吸血蚊類介導(dǎo),引起特定的人畜群體的季節(jié)性、地方流行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染和病毒血癥。除日本腦炎、登革熱和基孔肯尼亞熱主要流行于東亞和非洲外,美洲大陸是上述大部分病原的疫源地和流行區(qū)域。但近年來,隨著國際貿(mào)易的發(fā)展,各個大陸間的人流物流的迅猛發(fā)展,蚊傳播腦炎病毒有從其疫源地向其它地理區(qū)域傳播擴散的趨勢。目前,除日本腦炎外盡管我國尚未出現(xiàn)大面積流行,但我國卻廣泛存在上述病原的易感動物和傳播媒介。如果缺乏相應(yīng)的檢測防控技術(shù),特別是高通量檢測方法,讓此類病原體自由通過人流/物流經(jīng)國境關(guān)口傳入,將會引起嚴(yán)重的公共衛(wèi)生安全問題。為此,本論文旨在建立一種新型的檢測方法,對此類病原進行高通量的檢測,為保障國境口岸及國內(nèi)公共衛(wèi)生安全提供技術(shù)支撐。本論文獲得的主要研究成果如下:(1)以水泡性口炎病毒為載體,構(gòu)建了三株表達馬腦脊髓炎病毒E2蛋白的重組病毒:rVSV-EEEV-E2、r VSV-WEEV-E2、rVSV-VEEV-E2。重組病毒在BHK細胞上增殖良好,并通過電子顯微鏡、RT-PCR以及免疫熒光染色鑒定構(gòu)建正確。該重組病毒可以用作馬腦脊髓炎病毒的替代物,用做檢測方法標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。(2)通過加尾PCR法和體外轉(zhuǎn)錄的方法合成一系列新型的合成病毒RNA(svRNA),并通過測序和RT-PCR驗證。由于svRNA的兩側(cè)帶有病毒特異性引物的結(jié)合區(qū),內(nèi)部嵌入了來自于外源質(zhì)粒的基因片段,由此可以被用作后續(xù)檢測的病毒替代物,并具備驗證假陽性擴增的能力。結(jié)果表明,svRNA可以作為基因檢測試劑盒陽性質(zhì)控樣本。(3)應(yīng)用獨特的加尾法PCR和聯(lián)用微流控電泳芯片,開發(fā)了一種適用于基因檢測的WideSpace高通量擴增方法。據(jù)此開發(fā)了WsP-mRT-PCR聯(lián)用Lab-on-Chip(芯片實驗室)檢測12種蚊傳播腦炎病毒的檢測方法包括:東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒、拉科魯尼亞病毒、辛德畢斯病毒、日本腦炎病毒、圣劉易斯腦炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亞熱、Ⅲ型登革熱病毒。其中,東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒和圣劉易斯腦炎病毒通過OIE馬腦炎參考實驗室提供的標(biāo)準(zhǔn)病毒的測試和驗證。該方法的靈敏度為102拷貝/μL;方法的特異性和再現(xiàn)性均達到同類檢測方法的水平;方法的可靠性和熒光RT-PCR相當(dāng);其優(yōu)勢在于可以同時高通量的檢測多個病原。(4)開發(fā)了適用于病毒W(wǎng)sP-mRT-PCR檢測方法的分析軟件:《病毒特征判讀軟件V1.0》。該軟件基于基因擴增產(chǎn)物的濃度和長度可以對檢測數(shù)據(jù)進行自動的分析和結(jié)果報告。(5)應(yīng)用本研究建立的檢測方法,對來自于重慶市三峽庫區(qū)五個縣鎮(zhèn)的2000余只蚊子進行了本類病原的監(jiān)測。結(jié)果表明,有2/115(1.7%)的蚊子檢出乙型腦炎病毒,沒有發(fā)現(xiàn)東部型馬腦脊髓炎病毒、西部型馬腦脊髓炎病毒、委內(nèi)瑞拉型馬腦脊髓炎病毒、西尼羅河病毒、高地J病毒、拉科魯尼亞病毒、辛德畢斯病毒、日本腦炎病毒、圣劉易斯腦炎病毒、Ockelbo病毒、基孔肯尼亞熱、Ⅲ型登革熱病毒中的任何一種。(6)通過項目研究,制訂了SN行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)兩項:SN/T 2863-2011馬腦脊髓炎(東部型和西部型)檢疫技術(shù)規(guī)范和SN/T 2833-2011委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎檢疫技術(shù)規(guī)范。
[Abstract]:In recent years , with the development of international trade , the epidemic of epidemic central nervous system , such as epidemic encephalitis virus , West Nile virus , high J virus , Rakru帽a virus , Ockelbo virus , Japanese encephalitis virus , St . Lewis encephalitis virus , Ockelbo virus , Kikungunya fever , dengue virus , etc . ( 2 ) A series of novel synthetic viral RNA ( svRNA ) was synthesized by the method of tail PCR and in vitro transcription . The method has the advantages that : the eastern equine encephalitis virus , Western equine encephalitis virus , Venezuela type equine encephalitis virus , West Nile virus , high J virus , Rakorovirus , Ockelbo virus , Japanese encephalitis virus , St . Lewis encephalitis virus , Ockelbo virus , Kikungunya fever , and 鈪，

本文編號：1432222