本文關(guān)鍵詞：小豬急性肝衰竭模型的蛋白組學(xué)研究及臨床驗(yàn)證　出處：《浙江大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 急性肝衰竭 血清蛋白組學(xué) 生物學(xué)標(biāo)志物 能量代謝 果糖-1 6-二磷酸酶 視黃醇結(jié)合蛋白4

【摘要】：背景肝臟疾病種類繁多,病因復(fù)雜,每年因肝臟疾病死亡的人數(shù)逐年增加。其中,急性肝衰竭是一種病情發(fā)展迅速,死亡率高且治療手段有限的疾病,早期及時(shí)的診斷及準(zhǔn)確適宜的治療手段是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。目的本研究通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小豬急性肝衰竭模型的序貫性血樣的血清蛋白組學(xué)研究,描述疾病過(guò)程中蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化,篩選潛在的生物學(xué)標(biāo)志物,最終轉(zhuǎn)化至臨床驗(yàn)證,為急性肝衰竭的早期診斷及預(yù)后提供依據(jù)。方法選取38頭實(shí)驗(yàn)小豬靜脈給藥D-氨基半乳糖(1.3g/kg)建立急性肝衰竭模型。給藥前(P0)及給藥后36小時(shí)(P36)的混合血清(n=10)經(jīng)利用肽配體庫(kù)(CPLL)技術(shù)處理后分為高豐度表達(dá)部分(HAP)及低豐度表達(dá)部分(LAP),通過(guò)蛋白組非標(biāo)記定量(LFQ)檢測(cè)獲得差異蛋白列表。另選8頭實(shí)驗(yàn)小豬動(dòng)態(tài)時(shí)間點(diǎn)的血清樣品,預(yù)處理后經(jīng)平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)靶向定量初篩所得的差異蛋白列表。同時(shí),對(duì)實(shí)驗(yàn)小豬不同時(shí)間點(diǎn)的肝組織進(jìn)行透視電鏡、病理學(xué)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及免疫組化等綜合評(píng)估,從基因水平到組織蛋白水平檢驗(yàn)最終選擇的蛋白標(biāo)志物。最后,通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)分別檢測(cè)急性肝衰竭患者及健康人的血清蛋白標(biāo)志物(果糖-1,6-二磷酸酶,FBP1;視黃醇結(jié)合蛋白4,RBP4)濃度。結(jié)果基于數(shù)據(jù)依賴性采集(DDA)所得的鳥(niǎo)槍法對(duì)比檢測(cè)正常狀態(tài)及急性肝衰竭狀態(tài)下的小豬血清(n=10)蛋白質(zhì)表達(dá),結(jié)果共發(fā)現(xiàn)1589種血清蛋白質(zhì),其中變化顯著的差異蛋白325種。繼而經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)非依賴性采集(DIA)檢測(cè),結(jié)果分析可得可靠蛋白譜圖137種,蛋白質(zhì)生物功能分析提示其中線粒體及能量代謝蛋白變化最為顯著,共20種。平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(PRM)外部檢驗(yàn)另8頭實(shí)驗(yàn)小豬完整時(shí)間點(diǎn)的20種能量代謝相關(guān)蛋白的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果提示除了視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)給藥后即急速下降、剩余19種蛋白質(zhì)均持續(xù)上升。同時(shí),透視電鏡可見(jiàn)急性肝衰竭狀態(tài)下的肝細(xì)胞線粒體退行性改變,體積明顯腫脹、嵴消失、數(shù)目明顯減少;線粒體特異性基因(細(xì)胞色素氧化酶1/2,COX1/2)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示其基因表達(dá)量給藥后顯著減少。最終選擇視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)和果糖-1,6-二磷酸酶(FBP1)為候選蛋白標(biāo)志物。對(duì)候選標(biāo)志物的小豬肝臟免疫組化檢驗(yàn)結(jié)果與血清蛋白組學(xué)結(jié)果一致。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)急性肝衰竭患者血清,可見(jiàn)相比健康人,急性肝衰竭患者血清果糖-1,6-二磷酸酶濃度明顯升高(p0.05)、視黃醇結(jié)合蛋白4濃度顯著降低(p0.001)。根據(jù)隨訪資料對(duì)急性肝衰竭患者進(jìn)行短期(30天)生存分析,發(fā)現(xiàn)果糖-1,6-二磷酸酶具有與肝病終末期模型(MELD)評(píng)分相當(dāng)?shù)亩唐陬A(yù)后價(jià)值(曲線下面積AUC=0.778),且血清濃度高的患者(16.89μg/dL)相比濃度低的患者預(yù)后較差。結(jié)論急性肝衰竭過(guò)程中線粒體形態(tài)功能均明顯受損,能量代謝相關(guān)蛋白持續(xù)性升高。其中,視黃醇結(jié)合蛋白4及果糖-1,6-二磷酸酶可能可以作為急性肝衰竭的早期診斷及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。
[Abstract]:The background of liver disease variety, complex etiology, every year the number of liver disease death has increased year by year. Among them, acute liver failure is a rapid progression of the disease, high mortality and limited medical treatment disease, early diagnosis and timely accurate and appropriate treatment is the key to improve the prognosis of the patients. The purpose of this study of serum protein group based on the experimental pig model of acute liver failure by sequential blood studies, describes the dynamic changes of protein in disease process, screening of potential biological markers, eventually transformed into clinical verification, provide the basis for early diagnosis and prognosis of acute liver failure. Methods 38 head pig experimental intravenous administration of D-galactosamine (D- 1.3g/kg) to establish the model of acute liver failure. Before administration (P0) and 36 h after administration (P36) of the mixed serum (n=10) by using peptide ligand library (CPLL) after the treatment were divided into high abundance table As part of (HAP) and low abundance expression (LAP), through the group of non protein labeling (LFQ) detection of differential protein list. Serum samples and 8 experimental pig head dynamic time points, after pretreatment by parallel reaction monitoring (PRM) targeting quantitative screening the differential protein list. At the same time, the liver tissues of experimental pigs at different time points of Pathology, transmission electron microscopy, polymerase chain reaction (PCR) comprehensive evaluation and immunohistochemistry, protein markers from gene level to protein level test the final choice. Finally, by means of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were detected in serum of patients with acute liver failure and the health markers (two fructose -1,6- phosphatase, FBP1; retinol binding protein 4, RBP4) concentration. Based on the results of data dependent acquisition (DDA) the detection of shotgun compared with normal state and acute liver failure under the condition of pig Serum protein (n=10) expression, the results of the 1589 serum proteins were found, including the significant changes of 325 kinds of proteins. Then through data dependent acquisition (DIA) detection, result analysis can get reliable protein spectra of 137 kinds of biological function of protein analysis showed that the mitochondrial energy metabolism and protein changes were most significant, a total of 20. Parallel reaction monitoring (PRM) external test of dynamic change of 20 kinds of proteins related to energy metabolism on the other 8 experimental pigs complete time points. Results suggest that in addition to retinol binding protein 4 (RBP4) after administration is rapidly decreased, the remaining 19 proteins have continued to rise. At the same time, the perspective of hepatocyte mitochondria degeneration electron microscope of acute liver failure under the condition of the change of volume was swelling, cristae disappeared, significantly reduce the number of mitochondria; specific gene (cytochrome 1/2, COX1/2) the results showed that the polymerase chain reaction Gene expression was significantly reduced after administration. The final selection of retinol binding protein 4 (RBP4) and two -1,6- fructose phosphatase (FBP1) as candidate protein markers. The pig liver immune group of candidate markers of inspection results and serum proteomic results. The determination of absorption by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) detection of serum patients with acute liver failure, compared to healthy people, serum -1,6- in patients with acute liver failure two fructose phosphatase concentration increased significantly (P0.05), retinol binding protein 4 concentrations were significantly decreased (p0.001). According to the short-term follow-up data on acute liver failure patients (30 days) survival analysis, found that fructose -1,6- two with liver phosphatase end at the end of the model (MELD) score of the short-term prognostic value of equivalent (area under the curve AUC=0.778), and serum concentration in patients with high (16.89 g/dL) compared with the low concentration of poor prognosis. Conclusion acute liver failure process Mitochondrial morphology and function were significantly impaired, and energy metabolism related proteins continued to rise. Among them, retinol binding protein 4 and fructose -1,6- two phosphatase could be used as biomarkers for early diagnosis and prognosis of acute liver failure.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R575.3;R-332

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