本文關(guān)鍵詞：人類腸道宏基因組SNP模式與疾病的關(guān)聯(lián)研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：微生物與人類健康密切相關(guān),它們與宿主之間是一個相互依存、相互作用、不可分割的整體。菌群與宿主之間相互交換能量物質(zhì)、傳遞信息,對宿主有營養(yǎng)、免疫、刺激生長和生物拮抗等作用。菌群對人的健康起到至關(guān)重要的作用,越來越多的研究報道疾病發(fā)生發(fā)展與微生物相關(guān)。涉及的疾病包括肥胖、糖尿病、肝硬化、各類腸病、中風(fēng)、自閉癥和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等等。這些研究著重尋找微生物物種和基因在不同樣本組中豐度的差異,如2型糖尿病患者的腸道微生物中產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度下降等。但由于基因序列的不同甚至單個堿基的差別都會導(dǎo)致基因功能的不同,因此宏基因組研究不能僅局限在物種和基因豐度上的分析,還應(yīng)該關(guān)注基因內(nèi)容的變化,例如單堿基突變、插入刪除以及結(jié)構(gòu)變化等。雖然目前已有對宏基因組SNP的初步研究,但與疾病的關(guān)聯(lián)研究還未見報道。如果能在大規(guī)模樣本下比較分析疾病與健康人群腸道微生物組基因組水平的變化,尋找疾病相關(guān)微生物組SNP模式,將對揭示微生物組與人類疾病關(guān)系提供全新的視角,為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的依據(jù)。據(jù)我們所知,目前國際上并沒有通過研究宏基因組SNP來探索疾病與微生物關(guān)聯(lián)研究的框架。因此,本研究從宏基因組SNP模式的角度出發(fā),構(gòu)建了相關(guān)分析框架,并將之應(yīng)用于2型糖尿病和肝硬化的分析。首先我們構(gòu)建了與疾病關(guān)聯(lián)的宏基因組SNP分析框架。這一框架包括測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、參考基因組構(gòu)建、序列比對、SNP查找及質(zhì)量控制、進(jìn)化樹分析、目標(biāo)物種和基因篩選、多重檢驗(yàn)校正、SNP注釋、基因注釋和富集分析、多克隆分析以及可視化展示。由于宏基因組自身存在微生物物種繁多、樣本個體差異大以及已知信息缺乏的特點(diǎn),我們在各個階段對數(shù)據(jù)進(jìn)行了有針對性的分析和優(yōu)化。為提高可信度,我們在SNP查找階段使用SAMTools和VarScan2兩個工具,對結(jié)果取交集;我們使用不同的突變堿基頻率進(jìn)行了反復(fù)分析,同時我們還使用突變堿基頻率對樣本進(jìn)行層次聚類和AP聚類,來判定多克隆問題對結(jié)果的影響;可視化展示階段,我們直觀的描繪了基因SNP模式在不同組之間的區(qū)別,使得對結(jié)果的解析更加容易。其次,我們使用構(gòu)建的框架對2型糖尿病與腸道宏基因組SNP的關(guān)系進(jìn)行了分析。我們下載了170個2型糖尿病患者和174個正常個體的糞便宏基因組測序數(shù)據(jù),對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后,我們使用MetaPhlAn2進(jìn)行了豐度分析,發(fā)現(xiàn)有86個物種在疾病組和正常組中具有顯著差異的相對豐度。與之前的報道相吻合,如產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌在糖尿病組中的缺乏,以及Firmicutes門與Clostridia綱的比例在2型糖尿病患者腸道中比正常個體腸道中更高。為了分析基因組與基因水平SNP的差異,我們在樣本集合中找到了356個普遍存在的物種用來做參考基因組,并進(jìn)行了質(zhì)控后數(shù)據(jù)的重新比對。我們發(fā)現(xiàn)有20個物種在樣本中出現(xiàn)率較高且滿足讀段覆蓋度的條件,其中包括多個Bacteroides屬下的物種。在這20個物種中,我們識別到5.94M的可信SNP。Bacteroides coprocola是唯一一個SNP密度在正常組和糖尿病組中存在統(tǒng)計學(xué)差異的菌種。進(jìn)化樹分析顯示,疾病組和正常組的B.coprocola富集在不同的cluster里。在基因水平,我們找到51579個滿足覆蓋度和樣本出現(xiàn)率的基因。對它們的SNP密度在兩組中的差異進(jìn)行檢驗(yàn),有1300個基因在正常組和糖尿病組中存在差異的SNP模式。通過對偏性SNP的富集分析,我們篩選到65個需重點(diǎn)關(guān)注的基因。這65個基因均來自于B.coprocola,且第1名和第6名均為糖基水解酶,提示微生物的糖基水解功能可能在糖尿病發(fā)生發(fā)展中存在作用。進(jìn)化樹和SNP模式的分析也進(jìn)一步確定了這些基因在正常組和糖尿病組中的差異。我們還基于MuAF對樣本進(jìn)行了聚類,得到了與之前一致的結(jié)果。另外選取MuAF0.8和MuAF0.2的SNP重新做了分析,結(jié)果仍具有高度一致性。這一分析從多克隆方面對我們的結(jié)果進(jìn)行了支持和驗(yàn)證。最后,我們對肝硬化與腸道宏基因組SNP的關(guān)系進(jìn)行了同樣的分析。我們下載了123個肝硬化患者和114個正常人的糞便宏基因組測序數(shù)據(jù),在進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量控制之后,我們發(fā)現(xiàn)有121個物種的相對豐度在肝硬化組和正常組中存在統(tǒng)計學(xué)差異。為了找到在基因組水平的差異,我們使用362個符合條件的微生物物種做為參考基因組并進(jìn)行了重新比對。進(jìn)一步篩選后,有13個物種滿足覆蓋度、測序深度以及樣本數(shù)等條件。在這13個物種中,我們識別到3.93 M的可信SNP。其中Faecalibacterium cf.prausnitzii KLE1255是唯一一個SNP密度在正常組和肝硬化組中存在統(tǒng)計學(xué)差異的菌株。進(jìn)化樹分析顯示,疾病組和正常組的Faecalibacterium cf.prausnitzii KLE1255分別在不同的cluster里占優(yōu)勢。在基因水平,我們找到32603個基因滿足覆蓋度和樣本出現(xiàn)率的條件,有1245個基因在正常組和肝硬化組中存在差異的SNP模式。通過對偏性SNP(Biased SNP)的富集分析,篩選到279個需重點(diǎn)關(guān)注的基因,全部來自Faecalibacterium cf.prausnitzii KLE1255。我們對這些基因做了功能注釋和基因富集,其中前兩名分別編碼了一種丙酮酸合酶和一種ATP依賴性伴侶蛋白ClpB。進(jìn)化樹和SNP模式的分析也進(jìn)一步確定了這些基因在正常組和糖尿病組中的差異。在宏基因組領(lǐng)域,我們首次對微生物SNP模式與疾病之間的關(guān)聯(lián)展開研究。我們所構(gòu)建的框架同時具有高效性和可信度。利用這一框架,我們首次發(fā)現(xiàn)Bacteroides coprocola與2型糖尿病、Faecalibacterium cf.prausnitzii KLE1255與肝硬化之間的關(guān)聯(lián)。這些結(jié)論為宏基因組學(xué)研究開拓了新的方向,為后續(xù)的研究提供了新的線索和思路。
[Abstract]:In order to improve the reliability , we can find out the differences in gene function , such as obesity , diabetes , liver cirrhosis , various intestinal diseases , stroke , autism and rheumatoid arthritis . In order to analyze the differences between genome and gene level SNP , we found that there are a number of SNPs in the normal and normal groups .

【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R378

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本文編號：1401588