本文關(guān)鍵詞：原發(fā)性膽汁性肝硬化模型鼠發(fā)病過程中造血系統(tǒng)、細胞因子、腸道菌群的作用探究　出處：《中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：原發(fā)性膽汁性肝硬化(簡稱PBC)是一種由于免疫系統(tǒng)攻擊肝內(nèi)小膽管而引起的慢性膽汁淤積性自身免疫疾病。PBC以對線粒體自身抗原的耐受丟失和小膽管的破壞為特征。晚期病人會出現(xiàn)肝纖維化與肝硬化的發(fā)展,嚴(yán)重威脅患者的生命健康。在以往的研究中,我們建立了IL-2Rα(-/-)小鼠作為人類PBC的動物模型。IL-2Rα(-/-)小鼠的血清中出現(xiàn)抗線粒體抗體(AMA),組織病理學(xué)上存在著明顯的門脈炎癥和膽管破壞,肝臟中存在著CD4+T細胞與CD8+T細胞浸潤,多種炎性細胞因子的水平升高。這些結(jié)果表明IL-2Rα(-/-)小鼠能夠自發(fā)自身免疫性膽管炎,并具有多種類似于人類PBC的癥狀。而且這種小鼠同時自發(fā)產(chǎn)生炎癥性腸病(簡稱IBD),因此IL-2Rα(-/-)小鼠也可以用于研究腸道微環(huán)境(包括腸道菌群和腸道炎癥)與肝臟炎癥的相互作用。前期的研究工作顯示,在IL-2Rα(-/-)小鼠中敲除CD4會減輕結(jié)腸炎癥但不影響肝臟炎癥,而敲除CD8會減弱膽管破壞和門脈炎癥但不影響結(jié)腸炎癥。在IL-2Rα(-/-)小鼠中可以發(fā)現(xiàn)存在著比野生型對照小鼠增強的Th1和Th17型反應(yīng)。我們的前期工作證明IL-2Rα(-/-)小鼠的血清IL-12p40水平比IL-2Rα(+/-)小鼠要高。IL-12p40是1L-12與IL-23的共同亞基,IL-12與IL-23均屬于IL-12家族,IL-12家族在多種自身免疫病中有著較為重要的作用。尤其是在基于人類PBC的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中,IL-12相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)與PBC相關(guān)。但是IL-12p40在PBC中的具體作用尚不清楚。 因此我們嘗試在IL-2Rα(-/-)小鼠中敲除IL-12p40以研究IL-12p40在PBC中的作用,結(jié)果顯示相比IL-2Rα(-/-)小鼠,IL-12p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠可以作為一個更好的PBC模型。我們在這個模型之上對于造血干細胞、細胞因子、腸道菌群進行了深入的研究。得到的實驗結(jié)果如下： 1.IL-12p40的敲除加重了IL-IRα(-/-)小鼠的自身免疫性膽管炎癥并引起肝纖維化 令人驚奇的是p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠顯示出更加嚴(yán)重的門脈炎癥與膽管損傷,但是其腸炎顯著減輕。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠高比例出現(xiàn)脾腫大的癥狀,其脾臟與肝臟細胞數(shù)均顯著高于IL-2Rα(-/-)小鼠,但腸系膜淋巴結(jié)的細胞數(shù)要明顯低于IL-2Rα(-/-)小鼠。有趣的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的脾臟細胞數(shù)與肝臟細胞數(shù)呈正相關(guān),但腸系膜淋巴結(jié)的細胞數(shù)與肝臟細胞數(shù)沒有關(guān)聯(lián)。我們通過纖維化評分、羥脯氨酸含量測定、免疫組化、實時定量熒光PCR等多種方法證明,與IL-2Rα(-/-)小鼠最突出的區(qū)別是p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠能夠自發(fā)肝纖維化,以此可以模擬PBC患者病程中晚期癥狀。 我們分析了p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的表型,發(fā)現(xiàn)T細胞、CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例增高。p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的肝臟CD8+T細胞主要是效應(yīng)性記憶性細胞,而IL-2Ra(-/-)小鼠的肝臟CD8+T細胞主要是中樞性記憶性細胞。p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的肝臟CD4+T與CD8+T細胞主要是PD-1+的細胞,而IL-2Ra(-/-)小鼠的肝臟CD4+T與CD8+T細胞主要是PD-1-的細胞。與IL-2Ra(-/-)小鼠相比,p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的CD4+T細胞分泌IFN-y和IL-10的能力上升,而分泌IL-17A的能力下降。RT PCR的結(jié)果也證明p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠肝臟中Thl型反應(yīng)增強,Th17反應(yīng)受到抑制。 2. p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的造血系統(tǒng)異常 有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠與野生型小鼠相比,骨髓Lineage c-Kit+Sca-1l田胞(LSK細胞)的數(shù)目和比例都有所增加。p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠存在著髓外造血現(xiàn)象,表現(xiàn)在脾臟與肝臟中出現(xiàn)LSK細胞。LSK細胞通常被認(rèn)為包含有造血干細胞(HSC)和前體細胞。p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠中的骨髓LSK細胞表型與野生型小鼠相差很大,它們具有更大的細胞體積和顆粒度(高FSC和SSC),更低的CD86表達,并且CD150/CD48與CD34/CD135的表達方式不同。p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠骨髓中紅細胞、B細胞和NK細胞的比例與數(shù)目均降低,提示我們該小鼠的造血干細胞的造血功能存在障礙。令人驚奇的是,p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓LSK細胞高表達MHCII類分子,暗示這群細胞可能作為抗原提呈細胞(APC)行使功能,而野生型小鼠則不會出現(xiàn)類似特征。 我們發(fā)現(xiàn)p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓T細胞包括CD4+T細胞與CD8+T細胞的比例與數(shù)目均顯著升高。我們猜測骨髓T細胞對于LSK細胞的異常起著重要的作用。我們檢測年齡較小的小鼠的狀態(tài),發(fā)現(xiàn)3周與4周時的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠出現(xiàn)了明顯的脾臟腫大、骨髓T細胞浸潤和骨髓LSK細胞異常,而2周的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠卻沒有這些現(xiàn)象。因此我們假設(shè)小鼠在離乳后腸道細菌的改變可能通過T細胞來影響骨髓LSK細胞的異常。 我們使用骨髓嵌合的方法,對p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓造血能力是否改變進行了探究,將Ly5.2p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠與Ly5.1p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓細胞在用紅細胞裂解液處理后以1：1的比例進行嵌合,轉(zhuǎn)輸給致死劑量輻照過的Ly5.1/5.2小鼠中。8周后殺鼠檢測各臟器中來自Ly5.1小鼠與Ly5.2小鼠的細胞的比例。結(jié)果證明p40(-/-) IL-2Ra(-/-)小鼠全骨髓的重建能力要低于p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠。我們同樣進行了骨髓LSK細胞1：1嵌合的實驗,結(jié)果p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠LSK的重建能力要遠低于p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠,說明p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓LSK細胞很多都是造血功能較弱的前體細胞。 3. IFN-γ是p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠造血系統(tǒng)異常的關(guān)鍵細胞因子 由于p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓存在著增強的T細胞浸潤并且p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的T細胞高表達IFN-γ,我們猜想T細胞來源的IFN-γ對于LSK細胞失調(diào)起著至關(guān)重要的作用。我們將p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠與IFN-y(-/-)小鼠雜交得到p40(-/-)IFN-y(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠,并與p40(-/-) IL-2Ra(-/-)小鼠進行對比。我們發(fā)現(xiàn)p40(-/-)IFN-y(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠依然存在著肝臟炎癥,但是不再出現(xiàn)“巨脾”的現(xiàn)象。p40(-/-)IFN-y(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的T細胞在肝臟與脾臟中的比例并沒有改變,其表型依然處于高度活化狀態(tài)。然而我們發(fā)現(xiàn)在p40(-/-)IFN-y(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠骨髓中浸潤的T細胞的比例和數(shù)目下降,同時該小鼠骨髓中B細胞與紅細胞的比例和數(shù)目上升。重要的是,p40(-/-)IFN-y(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓LSK細胞的比例、數(shù)目與表型完全恢復(fù)正常,并且?guī)缀醪槐磉_MHCII類分子。這證明p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的造血系統(tǒng)異常完全依賴于IFN-γ。 4.腸道微生物參與調(diào)節(jié)p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的肝臟炎癥與造血系統(tǒng) 為了清除腸道中絕大多數(shù)的共生菌,我們用含有氨芐青霉素,甲硝唑,新霉素以及萬古霉素這四種抗生素的水從4周齡起飼養(yǎng)SPF級的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠。在抗生素喂養(yǎng)8周后,即小鼠12周時殺鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)清除腸道微生物可以顯著減輕p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的脾腫大和肝臟炎癥。清除了腸道菌的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的各臟器T細胞的比例和數(shù)目下降,并且T細胞的效應(yīng)性記憶細胞的比例下降,其分泌IFN-γ的能力也下降。清除了腸道菌的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的骨髓LSK細胞的比例和數(shù)目下降,一些LSK細胞異常的特征也得到一定程度的改善。這些數(shù)據(jù)證明了腸道共生菌在p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠中能夠促進肝臟炎癥和骨髓造血系統(tǒng)異常。 我們提取了p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠與p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠的結(jié)腸中糞便的基因組DNA,通過qPCR檢測16S RNA類型來測定一些種類細菌的含量。我們將p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠根據(jù)脾臟重量分成巨脾和非巨脾的2組,并將它們的結(jié)果與p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠進行對比。有意思的是,非巨脾的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的放線菌門、β-變形菌綱、γ-變形菌綱與乳酸桿菌群的含量比起巨脾的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠和p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠有所增高,而我們并沒有觀察到巨脾的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠和p40(-/-)IL-2Ra(+/-)小鼠之間存在著差異。非巨脾的p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠中失調(diào)的腸道菌群可能對于炎癥起到了抑制的作用。但是具體是那些細菌在p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠中起到何種作用尚不清楚。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的自身免疫性膽管炎加重同時結(jié)腸炎減輕,并且能夠自發(fā)肝纖維化,因此比起IL-2Ra(-/-)小鼠能夠更好的模擬人類PBC。本研究還發(fā)現(xiàn)了p40(-/-)IL-2Ra(-/-)小鼠的造血系統(tǒng)異常,出現(xiàn)了高表達MHCII類分子的造血干細胞樣細胞,而這些現(xiàn)象依賴于IFN-γ并且受腸道共生菌調(diào)節(jié)。利用該疾病模型中可以探討自身免疫性肝病中,肝臟炎癥與造血系統(tǒng)、細胞因子、腸道微環(huán)境之間的關(guān)系,這為研究PBC的致病機制以及尋找有效的治療靶點提供了理論依據(jù)。
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【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2;R-332

【參考文獻】

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1 George Kolios;Vassilis Valatas;Elias Kouroumalis;;Role of Kupffer cells in the pathogenesis of liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2006年46期

2 Franck Verrecchia;Alain Mauviel;;Transforming growth factor-β and fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2007年22期

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本文編號：1392917