本文關鍵詞：福氏志賀菌新sRNA的識別及生物學功能研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：志賀菌(shigella spp.)為革蘭氏陰性菌,是引起細菌性痢疾的重要病原菌,主要通過糞口途徑傳播,侵襲并定植結腸上皮細胞而引起典型細菌性痢疾的癥狀,如里急后重、發(fā)熱、腹痛、腹瀉、休克等等。志賀菌根據抗原的結構和生化反應的不同主要分為4群,其中福氏志賀菌是發(fā)展中國家的主要流行菌株,以2a血清型為主。據世界衛(wèi)生組織報道,全球每年感染細菌性痢疾的患者可達到1.6億,其中死亡病例約110萬,且2/3的感染者多為5歲以下的兒童。由于志賀菌的感染劑量極低(10-100個細菌),以及致病機理和宿主的免疫保護機制尚不完全清楚,所以細菌性痢疾的暴發(fā)流行嚴重危害了人類的健康,因此對福氏志賀菌的致病機制研究對我國細菌性痢疾的預防和治療具有重要意義。原核生物和真核生物中除了三種經典的RNA,如t RNA,r RNA,和m RNA外,還存在著一類新型的具有重要調控功能的RNA,非編碼RNA(nc RNA),在細菌中被統(tǒng)稱為small RNA(s RNA),大小在50-500nt之間,主要作用方式是通過堿基互補配對與靶標基因m RNA的5’UTR結合,進而影響m RNA的穩(wěn)定性和翻譯從而在轉錄水平上調控基因表達。有研究報道,細菌中的s RNA執(zhí)行著多種重要的生物學功能,如生長代謝,毒力調控,適應環(huán)境壓力等等。原核生物中s RNA的研究主要集中于大腸桿菌,已有近百種s RNA被發(fā)現,其功能也不斷被闡明。例如,在大腸桿菌中Mic F是長度為93nt的s RNA,它可以與omp F m RNA配對來抑制外膜蛋白omp F的表達[1];Oxys可以與編碼轉錄激活子fhl A結合進而抑制其翻譯[2],而目前福氏志賀菌的全基因組測序工作已完成,但還沒有針對福氏志賀菌系統(tǒng)地開展s RNA的識別和功能研究工作,因此開展福氏志賀菌s RNA的研究,并發(fā)現具有重要功能的s RNA,將加深對細菌致病機理等方面的理解,同時也對藥物研究和疫苗開發(fā)提供新的思路。首先,通過生物信息學的方法在福氏志賀菌中預測s RNA候選基因,根據s RNA高度保守性的特點,利用生物信息學的轉錄單元預測方法,通過尋找基因間區(qū)的啟動子或是終止子來預測新的s RNA,最后成功地在福氏志賀菌2a 301株中預測得到了57條候選s RNA。然后對生物信息學預測到的s RNA進行驗證,RT-PCR和Northern blot實驗最后確定新發(fā)現4條s RNA,分別命名為Ssr1、Ssr9、Ssr44和Ssr54。通過RACE實驗進一步確定了這4條s RNA的轉錄起始和終止位點,并獲得它們的全長序列信息。為研究新發(fā)現的s RNA在福氏志賀菌所發(fā)揮的生物學功能,采用λ-RED同源重組的方法成功地構建了Ssr1和Ssr54的2條s RNA的突變株。首先,研究s RNA對福氏志賀菌在不同環(huán)境壓力下生長狀態(tài)的影響,將野生株、Ssr1和Ssr54突變株及其回復株置于不同環(huán)境壓力培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h并繪制生長曲線,結果發(fā)現,Ssr1缺失后在p H5.0的酸性壓力下生長速度與野生株相比較為緩慢,Ssr54缺失后在高滲透壓環(huán)境壓力下生長速度與野生株相比明顯加快。為研究s RNA在福氏志賀菌響應不同環(huán)境壓力方面的功能,利用q RT-PCR方法檢測Ssr1和Ssr54在不同環(huán)境壓力下表達水平的差異,結果發(fā)現,Ssr1的表達水平在p H 2.0、p H 2.5、p H 3.0、p H 3.5和p H 4.0的酸性環(huán)境中相對于p H 7.0顯著升高,并且隨著p H值的升高Ssr1的表達逐漸降低,Ssr54在p H5.5、p H 6.0、p H 6.5、低滲透壓、營養(yǎng)缺乏和氧化應激環(huán)境壓力下的表達水平均有明顯升高,說明Ssr1和Ssr54通過響應不同環(huán)境壓力信號中來發(fā)揮生物學功能。對比野生株與Ssr1和Ssr54突變株在不同環(huán)境壓力刺激一定時間后的生存率,實驗發(fā)現Ssr1缺失后在酸性培養(yǎng)條件下生存率下降了22%,Ssr54缺失后在氧化應激壓力下生存率升高了30%,說明Ssr1和Ssr54在影響了福氏志賀菌耐受環(huán)境壓力的能力。通過以上研究發(fā)現,Ssr1和Ssr54通過響應外界環(huán)境壓力信號,進而改變自身的表達量,從而增強適應環(huán)境的能力。為了研究Ssr1和Ssr54是否在福氏志賀菌的致病方面發(fā)揮的功能,開展了豚鼠角膜結膜炎實驗和小鼠肺競爭性侵襲等毒力實驗,結果表明,Ssr1缺失后導致豚鼠角膜結膜炎癥反應增強,小鼠肺侵襲能力增強,這說明Ssr1的缺失使福氏志賀菌的毒力增強;而Ssr54缺失后豚鼠角膜結膜炎癥反應減弱,小鼠肺侵襲能力下降,說明Ssr54的缺失使福氏志賀菌的毒力減弱,以上結果說明Ssr1和Ssr54均參與了福氏志賀菌毒力功能的調控。為了進一步探索Ssr1和Ssr54在機體免疫應答中的功能,對野生株和兩條s RNA突變株感染過程中宿主產生的細胞因子進行檢測分析,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ。結果顯示Ssr1突變株感染小鼠24h后,與野生株相比,IL-1β的表達顯著升高;感染48h后,與野生株相比,TNF-α的表達顯著升高,說明Ssr1突變株感染早期Ssr1突變株可誘導TNF-α和IL-1β表達水平升高,使炎癥反應增強,與豚鼠角膜結膜炎的結果一致。Ssr54突變株感染小鼠后,與野生株細胞因子表達水平與野生株相比無明顯差異。為了深入研究Ssr1和Ssr54發(fā)揮生物學功能的具體作用機制,進一步利用雙向電泳尋找Ssr1和Ssr54潛在的靶標。經質譜分析Ssr1缺失共有51個蛋白差異點,其中27個下調蛋白,24個上調蛋白;Ssr54缺失共發(fā)現40個差異蛋白,其中25個下調蛋白,15個上調蛋白。對Ssr1和Ssr54缺失后表現出明顯差異且具有重要意義的蛋白進行了q RT-PCR驗證,即在轉錄水平上驗證相應蛋白編碼基因表達量的相應變化,包括Ssr1缺失后dnak,ipa A,mxi C,ipg C和ipa D的表達,以及Ssr54缺失后tol C,hns,tre F和omp A的表達,結果與雙向電泳結果一致。福氏志賀菌Ssr1通過響應酸性環(huán)境壓力信號,可能通過上調dnak的表達基因來提高福氏志賀菌耐受酸性環(huán)境壓力影壓力信號,上調dna K基因的表達提高耐受酸性環(huán)境壓力的功能的能力,并通過下調影響T3SS中的ipa A,mxi C,ipg C和ipa D基因的表達來降低引起福氏志賀菌的毒力功能的降低;Ssr54可能通過響應滲透壓等環(huán)境壓力信號,下調tre F降低耐受高滲壓力能力,并通過上調tol C和hns基因的表達來提高福氏志賀菌的毒力功能。s RNA發(fā)揮功能的機制可能是直接與靶標m RNA結合,或者間接調節(jié)靶標m RNA的表達,大多數s RNA需要Hfq蛋白的結合來調控靶標基因的表達進而發(fā)揮一定的生物學功能,為了揭示我們新發(fā)現的s RNA是否依賴Hfq來發(fā)揮功能,首先開展福氏志賀菌中Hfq的具體功能的研究。細菌中的Hfq蛋白(host factor for RNA phage Qβ)是一類高度保守的RNA結合蛋白,主要的生物學功能是通過結合并幫助s RNA與靶標m RNA結合來影響靶標基因的表達。已有研究表明Hfq在細菌中發(fā)揮多種生物學功能,包括環(huán)境壓力適應、耐受環(huán)境壓力、毒力等等。但是Hfq的大小在不同細菌中有所不同,如在大腸埃希菌中Hfq蛋白為102aa氨基酸,而在金黃色葡萄菌中為77aa氨基酸,不同細菌中Hfq發(fā)揮的功能和作用機制也不同,如銅綠假單胞菌、布魯氏桿菌中Hfq蛋白影響外毒素表達[3,4],大腸桿菌中Hfq還有ATP酶的活性,從而加速轉錄及翻譯過程[5]。因此深入研究福氏志賀菌中Hfq的功能及調控機制,將有助于對福氏志賀菌s RNA致病機制的深入研究。首先利用λ-RED同源重組的方法成功地構建了福氏志賀菌的hfq突變株。將hfq克隆到p ACU184低拷貝質粒中再轉入hfq突變株的方法構建了hfq回復株,并通過PCR的方法驗證證明構建成功。hfq突變株和回復株的構建為福氏志賀菌中hfq的功能研究奠定了基礎。hfq的缺失對福氏志賀菌生存及生長狀態(tài)影響做了生長曲線分析,結果顯示,與野生株相比,hfq突變株在正常條件下進入平臺期后生長速度明顯下降,在酸性環(huán)境壓力下生長速度在對數生長期較野生株明顯減慢。為研究hfq對福氏志賀菌不同環(huán)境壓力下生存能力的影響,我們進行了野生株和hfq突變株在不同生存環(huán)境壓力的生存率實驗,在高滲透壓、酸性及氧化應激刺激下,hfq突變株的生存率均較野生株有明顯的降低,降低的幅度在30%-60%之間,說明hfq在福氏志賀菌耐受環(huán)境壓力中發(fā)揮著至關重要的作用。為了研究hfq能否有效地響應環(huán)境壓力,利用q RT-PCR檢測了hfq在福氏志賀菌應對不同環(huán)境壓力下的表達情況,結果發(fā)現hfq在酸性和氧化應激壓力下表達水平顯著升高,同時發(fā)現在不同p H環(huán)境下耐酸相關基因(gad B,gad A,hde B,hde A和hde D)及毒力相關基因(ipa A,ipa B,ipa J,ipa H4.5,ipa H9.8,ipa H1.4,ipa H7.8,ipa H2.5,ipg D,ipg H,mxi C,mxi I,mxi M,spa13,spa15,spa33,spa P和spa9)的表達與hfq的表達具有顯著正相關性,并且均在p H2.0-4.0的環(huán)境壓力下表達水平最高,說明hfq能夠有效地響應酸性和氧化應激壓力信號。小鼠肺侵襲和He La細胞侵襲等毒力實驗的結果表明,hfq缺失后福氏志賀菌的侵襲力明顯下降,說明hfq對福氏志賀菌的毒力功能有一定影響。檢測野生株和hfq突變株感染小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ細胞因子產生的水平變化,結果發(fā)現感染24h后,hfq突變株感染的肺泡灌洗液中TNF-α表達與野生株相比明顯降低,炎癥反應減弱,與豚鼠角膜結膜炎表現的結果一致,說明hfq缺失后影響了福氏志賀菌引起的機體免疫應答的改變,細胞因子分泌下降炎癥反應減弱。為研究hfq發(fā)揮適應環(huán)境壓力和毒力方面的作用機制,利用q RT-PCR檢測了T3SS相關基因和耐酸相關基因在hfq突變株和野生株中的表達情況,結果發(fā)現hfq突變株中T3SS相關基因基本不表達,耐酸相關基因的表達與野生株相比也明顯降低。以上結果說明,hfq通過響應酸環(huán)境壓力信號,上調耐酸相關基因來提高福氏志賀菌耐受酸環(huán)境壓力能力,上調T3SS相關基因來影響福氏志賀菌的毒力輸出的提高。本研究中新發(fā)現的Ssr1和Ssr54均參與福氏志賀菌適應環(huán)境壓力和毒力的調控過程,在hfq相關研究中也發(fā)現了類似的功能調控,特別是Ss1和hfq均參與了T3SS的調控,目前,我們正在開展相關實驗來驗證Ssr1是否與Hfq蛋白結合來發(fā)揮生物學功能。此外,我們首次報道了我國新出現的福氏志賀氏菌1c亞型,并對其進行了多位點序列分型分析和耐藥性研究,同時首次發(fā)現我國的1c型福氏志賀菌對喹諾酮和頭孢類抗生素耐藥性。綜上所述,本研究結合生物信息學和實驗驗證的方法在福氏志賀菌中新發(fā)現了4條s RNA。對福氏志賀菌新發(fā)現兩條s RNA和Hfq功能研究中發(fā)現,它們通過響應不同環(huán)境壓力的變化,調節(jié)相應壓力基因,影響毒力基因的表達,進而表現為毒力輸出的改變。Hfq是否與我們新發(fā)現這兩條s RNA結合來共同發(fā)揮功能是我們下一步重點開展的研究。這些發(fā)現將有助于加深對志賀菌致病性的了解認識,為抗志賀菌感染提供新的分子靶標,也為闡明志賀菌感染的致病機制的研究提供參考和借鑒。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378

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