本文關(guān)鍵詞：問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的酶學(xué)活性和功能分析　出處：《浙江大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的 問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體(簡(jiǎn)稱鉤體)是引起鉤體病的重要病原體,人類通過(guò)被帶菌動(dòng)物尿液污染的疫水或疫土而感染,趨化和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)在鉤體感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。鉤體基因組序列分析證明其中有數(shù)個(gè)趨化調(diào)節(jié)蛋白CheB和CheR的編碼基因,但其具體的調(diào)控機(jī)制未知。方法1、Real-timePCR檢測(cè)了鉤體基因組中5個(gè)基因在鉤體感染宿主細(xì)胞過(guò)程中mRNA的水平變化;2、T-A克隆了 CheB和CheR的編碼基因片段并構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng);3、檢測(cè)了 c-di-GMP濃度變化對(duì)CheB和CheR表達(dá)菌株表型的影響。結(jié)果1、在感染細(xì)胞60min后,cheB1的mRNA水平顯著提高,cheB3也有一定程度的提高,而cheB2和cheR則無(wú)明顯差異;2、成功構(gòu)建了 5個(gè)基因的原核表達(dá)系統(tǒng),其中重組CheB1、CheB3和CheR2蛋白使大腸桿菌運(yùn)動(dòng)能力明顯增強(qiáng);3、在加入鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑和磷酸二酯酶抑制劑后,各表達(dá)菌株形成菌落大小與對(duì)照相比無(wú)明顯不同,但CheB2菌落形態(tài)與對(duì)照相比出現(xiàn)明顯褶皺。結(jié)論CheB和CheR可影響大腸桿菌的swarming運(yùn)動(dòng)能力,并受胞內(nèi)c-di-GMP濃度的影響。目的鉤體病是由致病性鉤端螺旋體引起的全球流行的人畜共患病,每年有超過(guò)50萬(wàn)的病例報(bào)告。環(huán)二鳥苷信號(hào)系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌體內(nèi)的新型二元信號(hào)系統(tǒng),可以感知外界環(huán)境信號(hào)并調(diào)控細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、毒力和生物膜形成等多種生理功能。環(huán)二鳥苷酸信號(hào)分子在胞內(nèi)的代謝由含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的二鳥苷環(huán)化酶(diguanylate cyclase,DGC)和含有EAL或HD-GYP結(jié)構(gòu)域的磷酸二醋酶(phosphodiesterase,PDE)調(diào)控。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了鉤體兩個(gè)HD-GYP結(jié)構(gòu)域磷酸二酯酶的編碼基因LA2383和LA2847,但其具體功能未知。方法 1、通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)了鉤體基因組中LA2383和LA2847兩個(gè)基因在鉤體感染宿主細(xì)胞過(guò)程中mRNA水平的變化;2、采用T-A克隆等分子生物學(xué)方法構(gòu)建了L42383和LA2847基因的原核表達(dá)系統(tǒng);3、運(yùn)用酶標(biāo)儀及液相色譜儀檢測(cè)了純化的重組蛋白對(duì)特異性底物bis-pNPP、c-di-GMP、c-di-AMP、cGMP、cAMP及pGpG的磷酸二酯酶活性;4、構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)目的蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)的磷酸二酯酶活性。結(jié)果1、在感染宿主細(xì)胞12h時(shí),LA2383基因的mRNA水平明顯提高,LA2847基因的mRNA水平也有一定程度的提高;2、成功構(gòu)建了LA2383和LA2847基因的原核表達(dá)系統(tǒng),通過(guò)表達(dá)、純化或復(fù)性得到單一的目的蛋白;3、LA2383蛋白可以分解特異性底物bis-pNPP,對(duì)底物pGpG的酶活性要高于c-di-GMP,而LA2847蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)所用底物均無(wú)法分解;4、LA2383和LA2847基因在大腸桿菌BL21(DE3)中過(guò)表達(dá)后,細(xì)菌胞內(nèi)c-di-GMP水平下降。結(jié)論LA2383和LA2847基因的mRNA水平在鉤體感染細(xì)胞的過(guò)程中具有先降后升的趨勢(shì),在感染后12h達(dá)到峰值;HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白LA2383具有磷酸二酯酶活性,可以降解c-di-GMP和pGpG;過(guò)表達(dá)LA2383和LA2847蛋白使大腸桿菌胞內(nèi)c-di-GMP水平下降;因此,推測(cè)HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白在鉤體感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[Abstract]:The purpose of Leptospira interrogans (leptopira) is an important pathogen of causing human leptospirosis. By infected animal urine pollution water and soil disease or infection, chemotaxis and motility system play an important role in the process of Leptospira infection. Leptospira genome sequence analysis proved that the number of chemotaxis genes encoding regulatory proteins CheB and CheR, but the specific regulatory mechanism is unknown. Methods 1, Real-timePCR detected mRNA levels of 5 genes in the genome of Leptospira in Leptospira infection of host cells in the process; 2, T-A gene encoding fragment of CheB and CheR and construct a prokaryotic expression system; 3, the detection of c-di-GMP concentration effect the phenotypes of strains on CheB and CheR. The results of 1 in infected cells after 60min cheB1, the mRNA level increased significantly, cheB3 also has a certain degree of improvement, but there was no obvious difference between cheB2 and cheR; 2, was constructed successfully. The prokaryotic expression system of 5 genes, including CheB3 recombinant CheB1 and CheR2 protein of Escherichia coli movement ability significantly enhanced; 3, adding inhibitor of guanylate cyclase and phosphodiesterase inhibitor, the expression of strain formed colony size compared with the control without significantly different, but the colony of CheB2 compared with the control group significantly fold. Conclusion CheB and CheR can affect the swarming movement ability of Escherichia coli, and affected the intracellular c-di-GMP concentration. The purpose of leptospirosis is caused by pathogenic Leptospira global epidemic zoonosis, a case report of over 500 thousand each year. The cyclic Diguanylic signal system is widely existed in bacteria in vivo the new $two signal system, can sense the external environment signals and regulation of bacterial motility, virulence and biofilm formation and various physiological functions. Xie You cyclic Diguanylate in intracellular signal molecules Diguanylic ring domain containing GGDEF enzyme (Diguanylate cyclase, DGC) and EAL or HD-GYP domain containing two phosphoric acid vinegar (phosphodiesterase, PDE) enzyme regulation. Bioinformatics analysis showed that the hook two HD-GYP domain phosphodiesterase genes encoding LA2383 and LA2847, but its function is unknown. 1. By Real-time PCR to detect the changes of LA2383 and LA2847 of Leptospira genome two mRNA gene in Leptospira infection of host cells in the process; 2, we constructed a prokaryotic expression system of L42383 and LA2847 genes were cloned by T-A and other molecular biological methods; 3, using microplate and liquid chromatography. The purified recombinant protein of the specific substrate of bis-pNPP, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP and pGpG 4, phosphate phosphodiesterase activity; construct protein detection report plasmid in Escherichia coli two intracellular esterase activity. Results in 1. The infection of host cells 12h, LA2383 gene mRNA was significantly improved, the LA2847 gene mRNA level has been improved to a certain degree; 2, construct a prokaryotic expression system, LA2383 and LA2847 gene expression through purification, renaturation or single target protein; 3, LA2383 protein can decompose the specific substrate of bis-pNPP the enzyme activity on substrate, pGpG was higher than that of c-di-GMP and LA2847 protein on the substrate are not decomposition; 4, LA2383 and LA2847 gene in Escherichia coli BL21 (DE3) over expression, c-di-GMP level in bacteria cell decreased. Conclusion LA2383 and LA2847 gene mRNA level is decreased first and then increased trend in the process of Leptospira infected cells, and reached the peak at 12h after infection; HD-GYP domain protein LA2383 with phosphodiesterase activity, can degrade c-di-GMP and pGpG; overexpression of LA2383 and LA2847 protein in Escherichia coli intracellular water c-di-GMP Therefore, we speculated that HD-GYP fell flat; domain proteins play an important role in the process of Leptospira infection.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R377.5

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本文編號(hào)：1373270