本文關(guān)鍵詞：表達(dá)呼吸道合胞病毒（RSV）融合蛋白（F）的重組桿狀病毒構(gòu)建與特性　出處：《武漢大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)是引起嬰幼兒下呼吸道感染的重要病原,導(dǎo)致支氣管炎和肺炎,嚴(yán)重時(shí)可致患者死亡,給嬰幼兒的健康和生命安全帶來巨大威脅。接種疫苗是預(yù)防病毒性疾病的有效手段。為了有效預(yù)防RSV感染性疾病,人們一直在研制RSV疫苗,但是目前仍沒有疫苗獲得許可上市。因此,研發(fā)安全有效的RSV疫苗是預(yù)防RSV感染的首要任務(wù)。位于RSV病毒粒子表面的糖蛋白——融合蛋白(fusion protein, F)是其主要的保護(hù)性抗原,也是研制RSV亞單位疫苗的首選組分之一。本研究構(gòu)建了表達(dá)RSV F蛋白的重組桿狀病毒疫苗,探討了其免疫原性和抗RSV感染免疫應(yīng)答情況,以及先天免疫信號(hào)通路接頭蛋白分子VISA在抗感染免疫中的作用。1.以RSV A2株基因組RNA為模板,RT-PCR擴(kuò)增F蛋白的F1亞基(包含第155到524位氨基酸的F蛋白片段)編碼序列,克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中,在大腸桿菌E.coli中誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白,經(jīng)分離純化后,免疫新西蘭大白兔,制備抗F蛋白的多克隆抗體。ELISA檢測(cè)表明,制備的多克隆抗體效價(jià)大于106；免疫熒光染色證實(shí),抗F蛋白多克隆抗體能與重組桿狀病毒表達(dá)的F蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)。2.以RSV A2株基因組RNA為模板,RT-PCR分別擴(kuò)增全長(zhǎng)F蛋白(第1到574位氨基酸)編碼基因和包含F(xiàn)蛋白胞外區(qū)的截短F蛋白(tF)(第22到524位氨基酸)編碼序列,采用MultiBac系統(tǒng)構(gòu)建獲得以不同形式表達(dá)F蛋白的三種重組桿狀病毒-Bac-tF64、Bac-CF、Bac-CF/tF64。其中,Bac-tF64能將F蛋白胞外區(qū)展示在桿狀病毒包膜上；Bac-CF能在轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞后,內(nèi)源性地表達(dá)全長(zhǎng)F蛋白。Bac-CF/tF64既能將F蛋白胞外區(qū)展示在桿狀病毒包膜上,又能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)F蛋白。3.以BALB/c小鼠為模型,對(duì)三種重組桿狀病毒在機(jī)體中誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和抗感染免疫進(jìn)行了研究。特異性抗體及細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,Bac-tF/64免疫組小鼠血清IgG2a/IgG11, Th2類細(xì)胞因子(IL-4, IL-5, IL-10)水平較高：Bac-CF免疫組小鼠血清IgG2a/IgG11, Thl類細(xì)胞因子(IFN-γ和TNF-α)水平較高；Bac-CF/tF64免疫組小鼠血清IgG2a/IgGl1,但是Thl與Th2類細(xì)胞因子水平均較高,表明該組誘導(dǎo)Thl和Th2混合型免疫應(yīng)答,但是更偏向于Thl類。RSV攻毒感染試驗(yàn)結(jié)果表明,Bac-tF64和Bac-CF免疫組小鼠肺組織內(nèi)均能檢測(cè)到滴度約為102pfu per lung的RSV,但在Bac-CF/tF64免疫組小鼠肺組織內(nèi)未能檢測(cè)到RSV。肺研磨液細(xì)胞因子分析顯示,RSV感染后,Bac-tF64免疫組小鼠肺組織具有較高的Th2類細(xì)胞因子含量,Bac-CF免疫組小鼠肺組織具有較高的Thl類細(xì)胞因子含量,而Bac-CF/tF64組Thl與Th2類細(xì)胞因子含量均較高。病理分析顯示,RSV感染后,Bac-tF64免疫組小鼠肺內(nèi)產(chǎn)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),是疫苗增強(qiáng)性疾病(Vaccine Enhanced Disease,VED)的重要標(biāo)志,而Bac-CF和Bac-CF/tF64組只有輕微的炎癥。4.將先天免疫信號(hào)通路接頭蛋白VISA編碼序列插入到Bac-CF/tF64基因組中,構(gòu)建了共表達(dá)VISA的重組桿狀病毒Bac-CF/tF64/VISA。用Bac-CF/tF64/VISA免疫小鼠后,共表達(dá)VISA對(duì)F蛋白誘導(dǎo)的抗體水平?jīng)]有顯著影響(p0.05)。但是,能夠顯著降低Th2類細(xì)胞因子水平(p0.05),降低Th2類反應(yīng)。病理分析顯示,共表達(dá)VISA能明顯減弱免疫小鼠在RSV攻毒感染時(shí)出現(xiàn)的VED現(xiàn)象。我們的研究成果將為研發(fā)基于F蛋白的RSV疫苗和發(fā)展新型疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Respiratory syncytial virus (Respiratory syncytial, virus, RSV) is an important pathogen of lower respiratory tract infection in children, lead to bronchitis and pneumonia, severe cases can cause death in patients, brings a huge threat to children's health and life safety. Vaccination is the effective means of preventing viral diseases. In order to effectively prevent RSV infection has been in the development of RSV vaccine, but there is still no vaccine licensed market. Therefore, the development of safe and effective RSV vaccine is the primary task of prevention of RSV infection. At the surface of RSV virion glycoprotein - fusion protein (fusion protein F) is the main protective antigen, but also the development of the preferred group RSV subunit vaccine one of the points. This study constructed recombinant baculovirus vaccine expressing RSV F protein, investigate the immunogenicity and immune response against RSV infection, and congenital Immune signaling adaptor protein molecule VISA in anti infection effect in RSV.1. immune A2 strain genomic RNA as template, F1 amplification of the F subunit of RT-PCR protein (containing 155th to 524 amino acid fragment of F protein) encoding sequence was cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a and expression of recombinant protein in Escherichia coli E.coli in the purified and immunized New Zealand rabbits, showed that the polyclonal antibody against F protein by.ELISA detection system, the titer of polyclonal antibody is greater than 106; immunofluorescence staining confirmed that anti F polyclonal antibody with recombinant baculovirus expressed F protein had specific reaction with.2. RSV A2 genomic RNA as template, RT-PCR amplification of full-length F protein respectively (first to 574 amino acids) F protein encoding gene and F protein contains the extracellular domain of truncated (tF) (twenty-second to 524 amino acid sequence encoding), constructed by MultiBac system Three kinds of recombinant baculovirus -Bac-tF64 and F protein expression in different forms of Bac-CF, Bac-CF/tF64., Bac-tF64 to F protein extracellular display in the baculovirus envelope; Bac-CF in the transduction of mammalian cells, endogenous expression of full-length F protein.Bac-CF/tF64 protein extracellular F can be displayed in the baculovirus envelope, and in mammalian cells the expression of F.3. protein in BALB/c mouse model of immune response of three recombinant baculovirus induced in the body and anti infection immunity were studied. Specific antibody and cytokine ELISA assay showed that Bac-tF/64 immunized mice serum IgG2a/IgG11, Th2 cytokines (IL-4, IL-5, IL-10 high level: Bac-CF) immunized mice serum IgG2a/IgG11, Thl cytokines (IFN- and TNF-) with high levels of Bac-CF/tF64 in serum of mice; immune IgG2a/IgGl1, But Thl and Th2 cytokines levels were higher, showed that the group induced by Thl and Th2 mixed type immune response, but in favor of Thl.RSV infection test results showed that Bac-tF64 and Bac-CF immunized mice were detected in lung tissue was approximately 102pfu per lung RSV, but failed to display in the analysis Bac-CF/tF64 immunized mice lung tissue RSV. was detected in lung grinding fluid cytokine, RSV infection, Bac-tF64 immunized mice lung tissue with higher levels of Th2 cytokines, Bac-CF immunized mice lung tissue with Thl cytokine content was higher, while the Bac-CF/tF64 group of Thl and Th2 cytokines pathological content were higher. The analysis showed that RSV infection, immune Bac-tF64 mice lung had a severe inflammatory response, vaccine enhanced disease (Vaccine Enhanced, Disease, VED) the important symbol, while the Bac-CF and Bac-CF/tF64 group Only mild inflammation.4. innate immune signaling pathway VISA adaptor protein encoding sequence inserted into the genome of Bac-CF/tF64, were constructed recombinant baculovirus expressing Bac-CF/tF64/VISA. VISA mice immunized with Bac-CF/tF64/VISA, co expression of F protein induced by VISA antibody levels had no significant effect (P0.05). However, can significantly reduce the level of Th2 type cytokines (P0.05), lower class Th2 reaction. Pathological analysis showed that co expression of VED VISA can significantly weaken the immune mice appeared in RSV infection. The results of our research will be to research and development of new vaccine adjuvant RSV vaccine based on F protein of the foundation.

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1368660