RNR2調(diào)控的重組綠色熒光蛋白酵母細(xì)胞的構(gòu)建及其對(duì)化學(xué)誘變?cè)母咄亢Y選
本文關(guān)鍵詞：RNR2調(diào)控的重組綠色熒光蛋白酵母細(xì)胞的構(gòu)建及其對(duì)化學(xué)誘變?cè)母咄亢Y選 出處：《中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志》2013年03期 論文類型：期刊論文
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【摘要】：目的建立RNR2調(diào)控的酵母增強(qiáng)綠色熒光蛋白(yEGFP)發(fā)光酵母細(xì)胞,高通量篩選化學(xué)誘變?cè)７椒ㄓ肞CR方法從酵母(W303-1A)基因組擴(kuò)增RNR2啟動(dòng)子,經(jīng)酶切后,用T4連接酶與線性化的含酵母嗜好遺傳密碼子的yEGFP報(bào)告載體相連,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定,構(gòu)建RNR2調(diào)控的yEGFP酵母報(bào)告載體。用醋酸鋰方法將其轉(zhuǎn)化于W303-1A酵母細(xì)胞,從而構(gòu)建成RNR2調(diào)控的yEGFP發(fā)光酵母細(xì)胞(W303-1A/RNR2-yEGFP)。用甲磺酸甲酯0～400mg·L-1分別作用于該發(fā)光酵母細(xì)胞0,4,8,12,16和20h后,于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光,用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光發(fā)光強(qiáng)度,選擇最佳誘導(dǎo)時(shí)間;用不同濃度的DNA烷化劑、DNA斷裂劑和DNA合成酶抑制劑作用于該重組細(xì)胞16h,檢測(cè)其熒光發(fā)光強(qiáng)度,考察W303-1A/RNR2-yEGFP細(xì)胞對(duì)各種化學(xué)誘變?cè)拿舾行�。結(jié)果經(jīng)測(cè)序確定W303-1A/RNR2-yEGFP構(gòu)建成功。選擇16h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間;各種化學(xué)誘變?cè)cW303-1A/RNR2-yEGFP細(xì)胞作用16h后,與DNA發(fā)生結(jié)合的化合物中放線菌素D和溴乙錠誘導(dǎo)的發(fā)光度與對(duì)照組無明顯差別,發(fā)光倍數(shù)1.5;與DNA發(fā)生烷基化的化合物中,甲磺酸甲脂200mg·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)光度最強(qiáng),發(fā)光倍數(shù)為5.21,瘤可寧200μg·L-1誘導(dǎo)的發(fā)光倍數(shù)為1.9,而絲裂霉素C的發(fā)光度與對(duì)照組無明顯差別。在使DNA發(fā)生斷裂的誘變?cè)?順鉑250mg·L-1誘導(dǎo)的細(xì)胞最高發(fā)光倍數(shù)為3.7,其次4-硝基-N-氧化喹啉3.1mg·L-1、博來霉素12.5mg·L-1和福來霉素200mg·L-1,最高誘導(dǎo)倍數(shù)分別為2.35,2.26和2.53;在抑制DNA合成酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶的誘變?cè)?5-氟尿嘧啶500μg·L-1、羥基脲570.45mg·L-1和喜樹堿30mg·L-1所誘導(dǎo)的細(xì)胞最大發(fā)光倍數(shù)分別為2.36,2.65和2.53;而非基因毒性化合物秋水仙堿、刀豆氨酸和四環(huán)素誘導(dǎo)的發(fā)光度與對(duì)照無明顯差別。結(jié)論該重組發(fā)光酵母細(xì)胞可用于對(duì)多數(shù)造成DNA斷裂或合成阻斷的化學(xué)誘變?cè)Y選,具有快速、方便和高通量等特點(diǎn)。
【作者單位】： 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室;揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金(81041111) 揚(yáng)州大學(xué)2011年度大學(xué)生學(xué)術(shù)科技創(chuàng)新基金(B11142)~~
【分類號(hào)】：R341
【正文快照】： 核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase,RNR)是普遍存在于細(xì)菌、酵母、人細(xì)胞和其他細(xì)胞中的合成脫氧核糖核苷三磷酸的限速酶,是生物體內(nèi)唯一的催化4種核糖核苷酸還原、生成相應(yīng)的脫氧核糖核苷酸的酶,在細(xì)胞內(nèi)DNA合成和修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用[1]。雖然不同類型RNR之間的氨
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