本文關鍵詞：RNR2調控的重組綠色熒光蛋白酵母細胞的構建及其對化學誘變原的高通量篩選　出處：《中國藥理學與毒理學雜志》2013年03期 　論文類型：期刊論文

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【摘要】：目的建立RNR2調控的酵母增強綠色熒光蛋白(yEGFP)發(fā)光酵母細胞,高通量篩選化學誘變原。方法用PCR方法從酵母(W303-1A)基因組擴增RNR2啟動子,經(jīng)酶切后,用T4連接酶與線性化的含酵母嗜好遺傳密碼子的yEGFP報告載體相連,連接產物轉化子質粒經(jīng)酶切和測序鑒定,構建RNR2調控的yEGFP酵母報告載體。用醋酸鋰方法將其轉化于W303-1A酵母細胞,從而構建成RNR2調控的yEGFP發(fā)光酵母細胞(W303-1A/RNR2-yEGFP)。用甲磺酸甲酯0～400mg·L-1分別作用于該發(fā)光酵母細胞0,4,8,12,16和20h后,于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光,用多功能酶標儀檢測其熒光發(fā)光強度,選擇最佳誘導時間;用不同濃度的DNA烷化劑、DNA斷裂劑和DNA合成酶抑制劑作用于該重組細胞16h,檢測其熒光發(fā)光強度,考察W303-1A/RNR2-yEGFP細胞對各種化學誘變原的敏感性。結果經(jīng)測序確定W303-1A/RNR2-yEGFP構建成功。選擇16h為最佳誘導時間;各種化學誘變原與W303-1A/RNR2-yEGFP細胞作用16h后,與DNA發(fā)生結合的化合物中放線菌素D和溴乙錠誘導的發(fā)光度與對照組無明顯差別,發(fā)光倍數(shù)1.5;與DNA發(fā)生烷基化的化合物中,甲磺酸甲脂200mg·L-1誘導的細胞發(fā)光度最強,發(fā)光倍數(shù)為5.21,瘤可寧200μg·L-1誘導的發(fā)光倍數(shù)為1.9,而絲裂霉素C的發(fā)光度與對照組無明顯差別。在使DNA發(fā)生斷裂的誘變原中,順鉑250mg·L-1誘導的細胞最高發(fā)光倍數(shù)為3.7,其次4-硝基-N-氧化喹啉3.1mg·L-1、博來霉素12.5mg·L-1和福來霉素200mg·L-1,最高誘導倍數(shù)分別為2.35,2.26和2.53;在抑制DNA合成酶或拓撲異構酶的誘變原中,5-氟尿嘧啶500μg·L-1、羥基脲570.45mg·L-1和喜樹堿30mg·L-1所誘導的細胞最大發(fā)光倍數(shù)分別為2.36,2.65和2.53;而非基因毒性化合物秋水仙堿、刀豆氨酸和四環(huán)素誘導的發(fā)光度與對照無明顯差別。結論該重組發(fā)光酵母細胞可用于對多數(shù)造成DNA斷裂或合成阻斷的化學誘變原篩選,具有快速、方便和高通量等特點。
【作者單位】： 揚州大學醫(yī)學院預防醫(yī)學教研室;揚州大學動物科學與技術學院環(huán)境衛(wèi)生學教研室;
【基金】：國家自然科學基金(81041111) 揚州大學2011年度大學生學術科技創(chuàng)新基金(B11142)~~
【分類號】：R341
【正文快照】： 核糖核酸還原酶(ribonucleotide reductase,RNR)是普遍存在于細菌、酵母、人細胞和其他細胞中的合成脫氧核糖核苷三磷酸的限速酶,是生物體內唯一的催化4種核糖核苷酸還原、生成相應的脫氧核糖核苷酸的酶,在細胞內DNA合成和修復過程中起關鍵作用[1]。雖然不同類型RNR之間的氨

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本文編號：1323974