本文關(guān)鍵詞：基于沙門菌鞭毛蛋白的H7N9亞型禽流感亞單位疫苗構(gòu)建及其免疫應(yīng)答特性　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： H7N9亞型禽流感病毒 血凝素 鞭毛蛋白 亞單位疫苗 黏膜免疫

【摘要】：自2013年3月,H7N9亞型禽流感病毒在我國傳播,其高感染率以及不斷提高的人傳染人的可能性引起了全球關(guān)注。重組亞單位疫苗能對(duì)病毒感染提供安全、特異的免疫保護(hù)。但是,亞單位疫苗的免疫原性比傳統(tǒng)疫苗(如滅活全病毒疫苗)弱,需要添加佐劑來增強(qiáng)其作用。研究表明細(xì)菌鞭毛蛋白具有很強(qiáng)的佐劑活性,可以促進(jìn)抗原誘導(dǎo)高效的免疫應(yīng)答。人感染H7N9亞型禽流感病毒病例不斷地出現(xiàn),迫使研究者們快速開發(fā)出安全有效的疫苗,尤其是黏膜亞單位疫苗,因?yàn)橥ㄟ^滴鼻免疫的疫苗不但能預(yù)防流感,還能在病毒感染的初始部位阻斷病毒感染。1.H7N9亞型禽流感病毒血凝素HA1-2基因與鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白基因fliC的融合表達(dá)及鑒定本研究利用overlap-PCR技術(shù)將H7N9亞型禽流感病毒血凝素球狀部(HA1-2,aa 62-284)基因連接到鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白基因夠iC)的N端,獲得目的基因片段HA1-2-fliC(2187 bp),另外還單獨(dú)擴(kuò)增了HA1-2片段(669 bp)。將它們分別與pCold載體連接、轉(zhuǎn)化,通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出HA1-2-fliC和HA1-2蛋白。SDS-PAGE結(jié)果顯示大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)能夠成功表達(dá)出HA1-2-fliC和HA1-2,蛋白大小與預(yù)期一致。分別用抗fliC和抗H7N9亞型禽流感病毒的多抗血清對(duì)蛋白進(jìn)行Western blotting分析,結(jié)果顯示HA1-2-fliC和HA1-2均具有良好的免疫反應(yīng)性。另外,TLR5生物活性試驗(yàn)顯示,HA1-2-fliC能刺激HEK293-mTLR5細(xì)胞分泌高水平IL-8,說明HA1-2-fliC具有體外活化TLR5的生物功能,而HA1-2蛋白則不能。以上研究結(jié)果表明融合蛋白能正確折疊出HA1-2和fliC兩部分的天然構(gòu)象。2.腹腔注射免疫融合蛋白HA1-2-fliC誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特性將HA1-2和HA1-2-fliC以腹腔注射方式免疫C3H/HeJ小鼠,間隔14和28天進(jìn)行加強(qiáng)免疫,并設(shè)立PBS為陰性對(duì)照。在二免、三免12天分別采血,通過ELISA和HAI試驗(yàn)檢測(cè)小鼠血清中的抗體水平。與HA1-2免疫組相比,HA1-2-fliC誘導(dǎo)出顯著且強(qiáng)烈的血清IgG抗體應(yīng)答,且在小鼠體內(nèi)維持至少3個(gè)月。另外,我們檢測(cè)了三免12天小鼠血清中的IgG亞型,結(jié)果表明融合蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生相似水平的IgG1和IgG2a應(yīng)答,均顯著高于HA1-2免疫組,同時(shí)能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的HAI抗體。綜上所述,融合蛋白中的鞭毛蛋白能夠顯著提高HA1-2的免疫原性,促進(jìn)HA1-2特異的免疫應(yīng)答,融合蛋白可以成為一種有潛力的H7N9亞型禽流感亞單位疫苗候選株。3.滴鼻免疫融合蛋白HA1-2-fliC誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答特性為進(jìn)一步評(píng)價(jià)鞭毛蛋白能否成為H7N9亞型禽流感亞單位疫苗的黏膜佐劑,以HA1-2和HA1-2-fliC滴鼻免疫C3H/HeJ小鼠,間隔14和28天進(jìn)行加強(qiáng)免疫,并設(shè)立PBS為陰性對(duì)照,CTB佐劑作為陽性對(duì)照。檢測(cè)三免12天后小鼠的體液、細(xì)胞和黏膜免疫應(yīng)答。ELISA結(jié)果顯示HA1-2-fliC能夠顯著提高小鼠血清及黏膜灌洗液(鼻腔和支氣管肺泡灌洗液)中的IgG和IgA抗體水平。對(duì)于細(xì)胞免疫應(yīng)答,我們檢測(cè)了三免后12天小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖與細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果顯示,與HA1-2免疫組相比,HA1-2-fliC能顯著提高淋巴細(xì)胞的增殖和活化,促進(jìn)IFN-y和IL-4的分泌,誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答,這與IgG亞型的檢測(cè)結(jié)果(與單獨(dú)HA1-2免疫組IgG1/IgG2a比率類似)是一致的。本研究為H7N9亞型禽流感黏膜亞單位疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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