本文關(guān)鍵詞：馬齒莧酰胺E對帕金森病模型的保護(hù)作用研究

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【摘要】：帕金森病(Parkinson's disease, PD)是世界第二大神經(jīng)退行性疾病。其主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的變性缺失導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少；其臨床表現(xiàn)為肌肉強(qiáng)直、靜止性震顫、運(yùn)動減少和步態(tài)異常。該病發(fā)病緩慢,呈進(jìn)行性加重,嚴(yán)重削弱了病人的運(yùn)動能力。左旋多巴是目前臨床用于治療帕金森病的常用藥物,它可以補(bǔ)充多巴胺的不足從而緩解PD癥狀,但對神經(jīng)細(xì)胞并無保護(hù)作用,長期服用甚至?xí)a(chǎn)生較多副作用,因此治療帕金森病的藥物仍有待開發(fā)。馬齒莧(Portulaca oleracea L.)為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物,其具有涼血止血、清熱解毒等功效,而且還具有抗氧化、抗老年癡呆、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用。最新研究發(fā)現(xiàn),馬齒莧提取物可以改善魚藤酮等多種神經(jīng)毒劑誘導(dǎo)的PD動物模型的運(yùn)動能力、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、增加紋狀體內(nèi)多巴胺含量。但是,馬齒莧提取物中抗PD藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。馬齒莧酰胺E (Oleracein E, OE)是本課題組從馬齒莧中提取得到的四氫異喹啉生物堿,鑒于OE具有顯著的抗氧化作用,對大劑量D-半乳糖／亞硝酸鈉誘導(dǎo)的老年癡呆衰老小鼠模型具有緩解氧化應(yīng)激、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用,我們推測OE是馬齒莧抗PD的活性成分之一。本文評價了OE對魚藤酮誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型和動物模型的作用。(1)利用5 μM魚藤酮致毒SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞24 h建立PD體外細(xì)胞模型,10μM OE預(yù)孵2 h再與魚藤酮共孵育24 h,檢測OE對魚藤酮致毒PD細(xì)胞模型的作用。通過測定乳酸脫氫酶(LDH)逸漏率、(?)UNEL染色、DCFH-DA染色、JC-1染色,分別檢測細(xì)胞的生存率、凋亡率、細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及線粒體膜電勢；用免疫印跡法(western-blot)檢測細(xì)胞ERK信號通路中MEK1/2和ERK1/2激酶以及凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、cytochrome c、cleaved caspase-3的表達(dá)。結(jié)果表明,與空白對照組相比,5 μM魚藤酮處理24 h后,SH-SY5Y細(xì)胞的LDH逸漏率顯著增加(p0.001)、凋亡率顯著上升(p0.001)、ROS水平顯著升高(p0.001)、線粒體膜電勢明顯降低；與空白對照組比較,魚藤酮處理1 h、12 h、24 h時ERK信號通路中總的ERK含量沒有發(fā)生明顯變化或略微有些降低,但p-MEK、p-ERK表達(dá)明顯提高,在24 h時p-ERK表達(dá)具有顯著性差異(p0.001)。此外,凋亡相關(guān)蛋白bax/bcl-2比率(p=0.005)、cytochrome c (p0.001)以及cleaved caspase-3 (p0.001)蛋白的表達(dá)都顯著增強(qiáng)。與魚藤酮模型組相比,10μMOE顯著降低了細(xì)胞LDH逸漏率(p0.001)、細(xì)胞凋亡率(p0.001)以及細(xì)胞內(nèi)ROS水平(p0.001),提高了細(xì)胞膜電勢；在魚藤酮處理1 h、12 h、24 h時,OE對p-MEK、p-ERK蛋白的表達(dá)都有抑制作用,在24 h時,對p-ERK蛋白表達(dá)的抑制作用最為顯著(p=0.002),且顯著抑制bax/bcl-2 (p=0.009)、cytochrome c (p=0.012)以及cleaved caspase-3 (p=0.003)蛋白的表達(dá)。(2)采用C57BL-6J小鼠灌胃給魚藤酮(30 mg/kg/d)56天,建立了PD小鼠模型。藥物處理組分別灌胃給予高劑量OE (15mg/kg/d)、低劑量OE (3 mg/kg/d)和陽性對照藥鹽酸司來吉蘭(10mg/kg/d)56天。采用自發(fā)活動實(shí)驗、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗、步態(tài)實(shí)驗檢測小鼠的運(yùn)動能力；測定小鼠中腦、紋狀體和血漿中的SOD活力和MDA含量,評價小鼠的氧化應(yīng)激水平；酪氨酸羥化酶(TH)免疫組化染色觀察小鼠中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元；免疫印記法(western-blot)檢測小鼠中腦和紋狀體ERK激酶的表達(dá)。結(jié)果顯示,與空白對照組相比,魚藤酮模型組小鼠在自發(fā)活動實(shí)驗中30 min內(nèi)的運(yùn)動距離顯著減少(p=0.028)；在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動時間顯著減少(p=0.033)；步態(tài)試驗中,小鼠的前后肢配合指數(shù)與同側(cè)后足步幅顯著性減小(p0.001),小鼠兩后爪足掌距離(p=0.01)顯著性增加；小鼠紋狀體(p=0.031)和血漿(p0.001)中SOD活力顯著降低,中腦SOD活力雖然降低,但差異不顯著(p0.05)；中腦(p=0.005)、紋狀體(p=0.045)和血漿(p0.001)中的MDA含量都顯著增加；免疫組化染色顯示小鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)(p=0.034)和TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p0.001)顯著性降低,樹突明顯變短或消失；此外,小鼠中腦(p=0.021)和紋狀體(p0.001)p-ERK表達(dá)均顯著升高。與魚藤酮模型組相比,OE高劑量組小鼠的運(yùn)動路程(p=0.001)、在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動時間(p=0.024)、前后肢配合指數(shù)(p=0.011)以及同側(cè)后足步幅(p=0.048)都顯著增加,小鼠兩后爪足掌距離減小但無顯著性差異(p0.05)；小鼠中腦(p=0.007)、紋狀體(p=0.022)和血漿(p0.001)中的SOD活力顯著增強(qiáng),MDA含量顯著減少(p=0.005,p=0.015,p0.001)；小鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)(p=0.004)和TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p=0.001)顯著性升高,多巴胺能神經(jīng)元樹突增多；中腦(p=0.043)和紋狀體(p=0.037)中p-ERK表達(dá)均顯著減少, 但凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2無顯著性變化(p0.05)。OE低劑量組小鼠與魚藤酮模型組相比,其前后肢配合指數(shù)(p=0.02)、同側(cè)后足步幅(p=0.016)都顯著升高,兩后爪足掌距離顯著減小(p=0.005),小鼠中腦黑質(zhì)致密部TH陽性細(xì)胞數(shù)(p=0.025)和TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p=0.012)顯著性升高;但其中腦及紋狀體的生化指標(biāo)以及p-ERK的表達(dá)沒有顯著性差異。司來吉蘭陽性對照組可提高小鼠在轉(zhuǎn)棒上的運(yùn)動時間(p=0.029)、前后肢配合指數(shù)(p=0.025)、同側(cè)后足步幅(p=0.029),降低兩后爪足掌距離(p=0.004)；提高血漿SOD活性(p=0.002),降低血漿(p0.001)、中腦(p0.001)、紋狀體(p=0.005)中的MDA含量,減少小鼠中腦神經(jīng)元凋亡,顯著性提高TH陽性神經(jīng)纖維光密度值(p=0.009),但中腦和紋狀體中p-ERK蛋白表達(dá)無顯著性變化(p0.05)。以上實(shí)驗結(jié)果表明,OE通過緩解小鼠氧化應(yīng)激,抑制小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的損傷、提高小鼠運(yùn)動能力,與陽性藥物司來吉蘭作用相似；但OE對ERK1/2磷酸化有顯著抑制作用,與司來吉蘭作用特點(diǎn)不同。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R285.5;R-332

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