本文關鍵詞：分泌型載脂蛋白E與丙型肝炎病毒顆粒的細胞外相互作用

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【摘要】：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是丙型肝炎的病原體,嚴重威脅著人們的健康。對于HCV感染尚無有效的疫苗,臨床上主要采用抗病毒策略進行治療,但存在諸多問題。HCV疫苗的研發(fā)需要我們加深對病毒的基礎研究以及其與宿主之間相互作用的認識。HCV的復制周期與宿主的脂代謝緊密相關,血液中的HCV病毒與脂蛋白等結合形成脂病毒顆粒(lipoviroparticles, LVPs),載脂蛋白E(apoE)作為LVPs的重要組成部分,在HCV病毒的復制周期中起到重要作用,但具體的作用機制尚不十分清楚。有研究通過RNA干擾技術下調Huh7.5細胞中apoE的表達使HCV病毒的感染性下調10-100倍,因此很多人認為apoE是HCV病毒感染復制所必需的蛋白。但是RNA干擾技術不能完全抑制蛋白的表達,因而不能完全確定apoE是否是HCV復制所必須的。本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除Huh7.5細胞中apoE的表達,并采用HCV進行感染,通過Western Blot、IFA、 qRT-PCR、IHC分別炔病毒蛋白、RNA以及感染性滴度方面檢測HCV病毒,說明apoE對HCV病毒的感染及復制并非是必需的；apoE在機體內主要由肝臟合成,并分泌到血液中,既存在于肝細胞內也存在于細胞外,研究認為apoE在細胞內與HCV結合進而在HCV的組裝機釋放過程中起重要作用,然而分泌至細胞外的apoE是否能與HCV結合一直未被證明,本研究通過轉染表達分泌型的apoE-HA,并與HCV病毒進行免疫共沉淀,結果表明HCV病毒能夠與分泌型的apoE在細胞外結合,同時對加入apoE的HCV進行滴度檢測表明這種結合能夠改變HCV病毒的感染性。由于HCV病毒顆粒能夠與apoE結合,E1E2膜蛋白位于病毒顆粒表面,有研究通過構建含有E1E2蛋白的HCV假病毒顆粒(HCVpp)并研究其與apoE之間的相互作用,結果HCVpp能夠與apoE發(fā)生相互作用,提示了HCV病毒顆粒通過膜蛋白E1E2與apoE發(fā)生相互作用。為了進一步探討研究apoE與E1E2之間的結合,通過穩(wěn)定轉染細胞系分別表達E1、E2、E1E2蛋白并與分泌型apoE-HA進行免疫共沉淀,實驗提示apoE與E1E2蛋白二聚體結合,與E1蛋白不發(fā)生結合,而與E2蛋白存在微弱的結合。E1E2膜蛋白是HCV疫苗研發(fā)中重要的抗原蛋白,與apoE的結合可能影響其免疫原性,為了確定E1E2蛋白進入機體能否被apoE結合,通過將E1E2與人血清進行免疫共沉淀,結果E1E2能夠與人血清中apoE結合。我們希望進一步尋找與apoE結合的膜蛋白位點,然而通過哺乳動物細胞雙雜交系統(tǒng)及免疫共沉淀實驗進行探討均未成功,還需要通過其他后續(xù)的實驗方法進一步深入探討與apoE結合的膜蛋白具體片段。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.21
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本文編號：1282929