本文關(guān)鍵詞：以果蠅表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)抗菌性多肽Trappin-2的S2細(xì)胞株

  更多相關(guān)文章： 真核表達(dá)載體 果蠅表達(dá)系統(tǒng) Trappin-蛋白 增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 S細(xì)胞

【摘要】：目的采用果蠅S2表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建可與S2細(xì)胞基因組整合的分別含有Trappin-2和EGFP的重組質(zhì)粒,篩選出兩種抗性穩(wěn)定可表達(dá)Trappin-2和EGFP的多克隆S2細(xì)胞株,為后期研究Trappin-2黏膜佐劑等生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)。方法首先對(duì)pMT/Bip/V5-His A果蠅表達(dá)載體進(jìn)行改造,去掉pMT/Bip/V5-His A的Bip信號(hào)肽,改造成為pMT/V5-His A,采用RT-PCR方法從A549細(xì)胞中得到含信號(hào)肽的、完整的Trappin-2基因,在引物的5'端引入NotⅠ酶切位點(diǎn)及Kozak序列;引物的3'端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)和雙終止密碼子。利用DNA重組技術(shù)將其定向插入到真核表達(dá)載體pMT/V5-His A中,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pMT-Trappin-2(簡(jiǎn)稱(chēng)pMT-T2)真核表達(dá)載體。為了觀(guān)察、比較轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平,同時(shí)構(gòu)建了帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EG-FP)的載體pMT/V5-His A-EGFP(簡(jiǎn)稱(chēng)pMT/EG-FP)。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù)將鑒定正確的兩種質(zhì)粒pMT-T2和pMT-EGFP分別與抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro(簡(jiǎn)稱(chēng)pro)共轉(zhuǎn)入果蠅S2細(xì)胞中,用含有300 mg/ml潮霉素B的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,經(jīng)過(guò)3～4周,篩選出兩種抗性穩(wěn)定多克隆S2細(xì)胞株,用終濃度為500μmol/L的CuSO4誘導(dǎo)表達(dá)48 h后,分別通過(guò)熒光顯微鏡、RT-PCR和Western blot分析目的蛋白在S2細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果采用RT-PCR方法從A549細(xì)胞中得到Trappin-2基因,通過(guò)NotⅠ和XhoⅠ雙酶切位點(diǎn)將Trappin-2克隆入改造好的pMT/V5-His A載體上,構(gòu)建了pMT-T2和pMT-EGFP質(zhì)粒,應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達(dá)載體和抗性篩選質(zhì)粒pro共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞,通過(guò)潮霉素B反復(fù)篩選,3～4周后,成功篩選到兩種穩(wěn)定的抗性多克隆細(xì)胞株,分別命名為S2-Trappin-2和S2-EGFP,用CuSO4分別誘導(dǎo)兩個(gè)細(xì)胞株,在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到S2-EGFP主要表現(xiàn)為胞漿綠色熒光,RT-PCR結(jié)果證實(shí)Trappin-2在S2細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá),Western blot分析S2-Trappin-2細(xì)胞培養(yǎng)上清可見(jiàn)分子量約10 ku的特異性條帶,成功建立可穩(wěn)定高表達(dá)Trappin-2和EGFP蛋白的果蠅S2細(xì)胞系。結(jié)論成功克隆了Trappin-2基因,并利用果蠅表達(dá)系統(tǒng)篩選到可分別穩(wěn)定表達(dá)Trappin-2和EGFP的S2細(xì)胞株。S2-Trappin-2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立為進(jìn)一步研究Trappin-2生物學(xué)特性、黏膜佐劑作用及在肺部感染等疾病中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室;北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院;
【基金】：北京市自然科學(xué)基金(編號(hào):7092053)
【分類(lèi)號(hào)】：R341
【正文快照】： 以果蠅表達(dá)載體系統(tǒng)構(gòu)建可穩(wěn)定表達(dá)抗菌性多肽Trappin-2的S2細(xì)胞株@趙秀玲$安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室!合肥230032碩士研究生 @何金生$北京交通大學(xué)生命科學(xué)與生物工程研究院!北京100044目的采用果蠅S2表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建可與S2細(xì)胞基因組整合的分別含有Trappin-2和EGFP的重組質(zhì)粒

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