本文關(guān)鍵詞：可溶性Tim-3在疾病中的表達(dá)及其意義的研究

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【摘要】：背景:我們的機(jī)體在受到損傷或刺激時(shí),會(huì)保護(hù)性的產(chǎn)生免疫及炎癥反應(yīng)。適當(dāng)?shù)拿庖呒把装Y反應(yīng)有利于健康的維持,自身穩(wěn)態(tài)的恢復(fù),而當(dāng)機(jī)體發(fā)生免疫及炎癥應(yīng)答過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),免疫監(jiān)視功能低下,免疫耐受被打破等情況,就會(huì)造成機(jī)體組織損傷,導(dǎo)致功能異常,乃至引發(fā)腫瘤及自身免疫性疾病等的發(fā)生。因此及時(shí)監(jiān)測(cè)、評(píng)估免疫及炎癥反應(yīng)的變化對(duì)于健康的維持及疾病的恢復(fù)具有重要意義。在機(jī)體組織、器官損傷或是功能異常的情況下,體內(nèi)隨之就會(huì)產(chǎn)生一些“標(biāo)志物”,人們將這些標(biāo)志物用于評(píng)價(jià)體內(nèi)的免疫及炎癥反應(yīng)或代謝狀態(tài),為疾病的診治提供了有力的手段。例如:在急性炎癥期,機(jī)體會(huì)因?yàn)镮L-6等細(xì)胞因子的刺激,誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成大量C反應(yīng)蛋白(C-reactive Protein,CRP);自身免疫疾病患者血清中會(huì)因?yàn)榭乖?抗體復(fù)合物在體內(nèi)蓄積,檢測(cè)到針對(duì)自身抗原的抗核抗體(Antinuclear antibody,ANA);糖尿病患者會(huì)因?yàn)橐葝u素抵抗或是分泌不足導(dǎo)致血糖異常升高;腎功能不全的患者由于腎臟泌尿功能減退或喪失,使代謝廢物潴留,會(huì)造成患者血液中尿素、肌酐等顯著升高。這些“標(biāo)志物”是臨床上對(duì)疾病診斷和病情評(píng)估的輔助手段,能客觀地評(píng)價(jià)病情嚴(yán)重程度和疾病預(yù)后。隨著科學(xué)的進(jìn)步尤其是基礎(chǔ)研究的深入,一些新的分子和蛋白被應(yīng)用到臨床,為臨床提供新的治療靶點(diǎn)和評(píng)估手段。T細(xì)胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(T cell Immunoglobulin and mucin3,Tim-3)是一種起初表達(dá)于活化的Th1細(xì)胞上的免疫檢查點(diǎn)分子,其配體為Galectin-9蛋白。Tim-3與其配體結(jié)合后可以通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡等機(jī)制負(fù)性調(diào)控免疫應(yīng)答。后來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達(dá)在巨噬細(xì)胞、DC等天然免疫細(xì)胞上。鑒于該分子在T細(xì)胞及天然免疫細(xì)胞上的高表達(dá)與多種免疫相關(guān)性疾病密切相關(guān),Tim-3被視作一個(gè)潛在的抗感染、抗腫瘤免疫干預(yù)靶點(diǎn),其發(fā)揮免疫調(diào)控的具體機(jī)制及應(yīng)用近來(lái)越來(lái)越受到人們的重視。近來(lái)發(fā)現(xiàn)除了膜結(jié)合型外,Tim-3還存在可溶型蛋白的形式,即可溶性Tim-3(soluble Tim-3,s Tim-3),其可能的來(lái)源包括Tim-3基因的選擇性拼接或細(xì)胞膜上的Tim-3蛋白的脫落。目前人們對(duì)于細(xì)胞膜上Tim-3的研究較多,認(rèn)識(shí)比較深入,而對(duì)于體內(nèi)可溶性Tim-3的來(lái)源及意義尚不清楚。目前認(rèn)為可溶性Tim-3可以通過(guò)以下兩種方式調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng):首先Tim-3的脫落使免疫細(xì)胞表面抑制性受體減少,提高免疫細(xì)胞活性;其次,可溶性Tim-3可以通過(guò)與細(xì)胞膜上的Tim-3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合其配體分子,阻斷配體介導(dǎo)的抑制性信號(hào),從而增強(qiáng)炎癥及免疫反應(yīng)。我們實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)一直關(guān)注Tim-3調(diào)控機(jī)制的研究,研發(fā)了一系列的Tim-3抗體、融合蛋白等制劑,重點(diǎn)探討了Tim-3對(duì)天然免疫的調(diào)控機(jī)制。鑒于我們發(fā)現(xiàn)Tim-3可溶性蛋白分子在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵作用如促進(jìn)巨噬細(xì)胞的活化及極化、增強(qiáng)免疫細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)等,我們推測(cè)血清中可溶性Tim-3的表達(dá)變化可能與多種炎性疾病的進(jìn)程相關(guān),具有潛在的研究和應(yīng)用價(jià)值。我們前期在臨床血清樣本中的檢測(cè)結(jié)果也提示,可溶性Tim-3的表達(dá)變化可能與炎性疾病病情相關(guān)。盡管也有一些另外的報(bào)道提示可溶性Tim-3的臨床價(jià)值,如報(bào)道顯示移植排斥中可溶性Tim-3水平的升高預(yù)示著排斥反應(yīng)的發(fā)生,但這方面的研究還不十分全面。因此在本研究中我們基于前期研究基礎(chǔ)、利用臨床資源,充分探討可溶性Tim-3在不同疾病中的表達(dá)變化及其臨床意義,期望為疾病的監(jiān)測(cè)提供新的標(biāo)志物分子。目的:綜上所述,本論文的研究目的主要有以下幾個(gè)方面:1.通過(guò)研究可溶性Tim-3在急性損傷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)、慢性腎臟病(Chronic Kidney Diseases,CKD)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)、腫瘤等各種急慢性炎癥患者血清中的表達(dá)水平,分析其在不同疾病中的表達(dá)有何不同,并分析可溶性Tim-3水平與CRP蛋白之間的關(guān)系;2.為了進(jìn)一步研究可溶性Tim-3與疾病進(jìn)展之間的關(guān)系,通過(guò)相關(guān)性分析明確慢性腎臟病患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中可溶性Tim-3水平與病程進(jìn)展之間的相關(guān)性,明確將其作為疾病監(jiān)測(cè)標(biāo)志物的可行性;3.初步闡明血清中可溶性Tim-3產(chǎn)生及影響炎癥反應(yīng)的機(jī)制,為今后的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。方法與結(jié)果1、在不同疾病患者血清中可溶性Tim-3的表達(dá)變化及其與炎癥反應(yīng)的關(guān)系1.1可溶性Tim-3在不同疾病中的表達(dá)變化為了觀察可溶性Tim-3在不同疾病中的表達(dá)有何不同,本實(shí)驗(yàn)收集2014年3月到2016年1月在我院住院的不同疾病患者188例,將其按診斷分為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組(41例)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡組(23例)、慢性腎臟病組(66例)、外傷組(17例)、糖尿病組(10例)、胃癌組(15例)、感染組(16例)、健康對(duì)照組(20例)。分別留取上述患者空腹血清及全血細(xì)胞,采用ELISA法檢測(cè)血清中可溶性Tim-3的表達(dá)水平,采用PCR方法分析外周血細(xì)胞中Tim-3 m RNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):可溶性Tim-3在急性創(chuàng)傷患者中表達(dá)顯著降低,在慢性炎癥性疾病及腫瘤中的表達(dá)升高。在SLE患者血細(xì)胞中Tim-3 m RNA的變化水平與血清可溶性Tim-3蛋白水平一致。該結(jié)果提示可溶性Tim-3可以作為體內(nèi)炎癥反應(yīng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。1.2可溶性Tim-3與炎癥指標(biāo)CRP的對(duì)比分析CRP作為重要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白,是反映炎癥嚴(yán)重和組織損傷大小的一個(gè)重要指標(biāo),除了用于急性感染的監(jiān)測(cè),CRP在慢性疾病中對(duì)于評(píng)估慢性炎癥性疾病活動(dòng)度、心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)等方面中也具有重要的參考價(jià)值。在急性炎癥階段,我們研究發(fā)現(xiàn)CRP的升高與可溶性Tim-3的降低之間沒(méi)有出現(xiàn)顯著的相關(guān)性。在慢性炎癥如SLE、CKD中CRP輕度升高,而此時(shí)可溶性Tim-3顯著升高,提示在慢性炎癥情況下可溶性Tim-3是一個(gè)比CRP更敏感、更具有潛在價(jià)值的指標(biāo)。2、血清可溶性Tim-3水平在評(píng)價(jià)CKD患者和SLE患者疾病進(jìn)展中的作用分析我們前面的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可溶性Tim-3在一些慢性炎癥中的表達(dá)顯著升高。為了進(jìn)一步探討其臨床意義,我們選擇了免疫及炎癥損傷相關(guān)的SLE及CKD作為研究對(duì)象,觀察了可溶性Tim-3與病程的相關(guān)性。我們的結(jié)果表明:1)CKD患者血清可溶性Tim-3表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組,且可溶性Tim-3表達(dá)水平與腎功能損傷呈正相關(guān),與腎小球?yàn)V過(guò)率評(píng)估值(e GFR)結(jié)果呈負(fù)相關(guān),證實(shí)了可溶性Tim-3表達(dá)水平與腎病的疾病進(jìn)展有相關(guān)性。另外還發(fā)現(xiàn)可溶性Tim-3與早期腎損傷檢測(cè)指標(biāo)β2微球蛋白(Beta2 microglobulin,β2-MG)相關(guān),有望成為早期腎損傷的指標(biāo)。(2)SLE患者血清中可溶性Tim-3表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度如累及器官的多少、補(bǔ)體C3水平等指標(biāo)存在相關(guān)。以上結(jié)果提示可溶性Tim-3可以作為監(jiān)測(cè)上述兩種疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)的新指標(biāo)。3、可溶性Tim-3的產(chǎn)生及作用機(jī)制研究。如前所述,可溶性Tim-3的來(lái)源有兩種即基因水平的表達(dá)升高和從細(xì)胞膜表面脫落的增加。我們?cè)谇懊娴难芯堪l(fā)現(xiàn)SLE、CKD中可溶性Tim-3蛋白水平與Tim-3 m RNA水平同步升高,提示疾病中可溶性Tim-3表達(dá)的升高可能來(lái)源于基因水平的表達(dá)升高。而另一方面,近來(lái)的研究提示金屬蛋白酶10(A Disintegrin and Metalloproteinase Domain 10,ADAM10)、金屬蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteinase Domain 17,ADAM17)等脫落酶可能參與了Tim-3從細(xì)胞膜上脫落的過(guò)程。因此為了證實(shí)患者中可溶性Tim-3的升高是否來(lái)源于細(xì)胞膜上的脫落,我們同時(shí)對(duì)患者中ADAM10、ADAM17兩種酶的表達(dá)進(jìn)行了同步分析,發(fā)現(xiàn)ADAM10、ADAM17表達(dá)水平與可溶性Tim-3的水平存在正相關(guān)關(guān)系,提示ADAM10、ADAM17表達(dá)引起的膜上Tim-3的脫落也是患者血清中可溶性Tim-3表達(dá)升高的原因之一。此外,我們還發(fā)現(xiàn)可溶性Tim-3蛋白可引起外周血中炎性小體相關(guān)的炎癥介質(zhì)包括白介素1β(Interleukin-1β,IL-1?)、白介素18(Interleukin-18,IL-18)等炎癥介質(zhì)表達(dá)的升高,部分解釋了可溶性Tim-3引發(fā)炎癥反應(yīng)的機(jī)制。結(jié)論:1.可溶性Tim-3在急性損傷及慢性炎癥中出現(xiàn)低表達(dá)及高表達(dá)兩種截然不同的變化。在慢性炎癥情況下可溶性Tim-3是一個(gè)比CRP更有潛在價(jià)值的指標(biāo)。2.在慢性疾病CKD及SLE中,可溶性Tim-3在監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展方面顯示出潛在的疾病監(jiān)測(cè)診斷價(jià)值。3.可溶性Tim-3的來(lái)源可能同時(shí)存在基因表達(dá)升高及脫落增加兩種方式,可溶性Tim-3的表達(dá)升高可能通過(guò)上調(diào)炎性小體相關(guān)分子等機(jī)制促進(jìn)炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R363

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