本文關(guān)鍵詞：PaP1 DNA聚合酶功能探索與酵母菌DNA聚合酶催化結(jié)構(gòu)域跨損傷動力學(xué)研究

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【摘要】：在病毒、原核、真核生物中,都包含有DNA聚合酶,它是DNA復(fù)制過程中較為重要的酶。噬菌體作為病毒,在其侵染宿主細(xì)菌、進(jìn)行增殖的過程中,以及在噬菌體自身的DNA復(fù)制過程中,都有DNA聚合酶的參與,并起到至關(guān)重要的作用。然而,我們對于噬菌體中的DNA聚合酶的認(rèn)知是有限的,許多噬菌體中的DNA聚合酶的工作機理我們并不清楚,很多潛在的功能還待挖掘。對于較為復(fù)雜的真核生物來說,DNA聚合酶在其機體的正常運轉(zhuǎn)與生命延續(xù)中也承擔(dān)了重要的角色,對于自身基因的變異和外界環(huán)境的刺激影響,DNA聚合酶都能夠輔助機體繼續(xù)完成DNA復(fù)制、跨損傷與修復(fù),它是生命遺傳物質(zhì)DNA進(jìn)行精確復(fù)制的保障。生命體中許多疾病都與遺傳基因DNA的損傷相關(guān),DNA損傷會造成DNA序列永久性的改變,從而產(chǎn)生疾病,導(dǎo)致遺傳特征的改變、功能喪失、畸形甚至死亡。機體本身會有自發(fā)性的變異,致使DNA復(fù)制時發(fā)生錯配、堿基發(fā)生改變等;同時在自然界中接觸到的物理性、化學(xué)性致?lián)p傷因素,也會導(dǎo)致DNA序列以及堿基發(fā)生突變,例如紫外線、電離輻射、烷基化試劑等等。DNA損傷所導(dǎo)致的疾病嚴(yán)重危害著人類的健康,通過研究DNA跨損傷復(fù)制以及修復(fù)等的機理,將為相關(guān)疾病的治療奠定基礎(chǔ)。銅綠假單胞菌噬菌體(Pseudomonas aeruginosa phage)PaP1作為一種新型的強制病性菌噬菌體,它的DNA聚合酶參與DNA復(fù)制的機理尚未研究,本課題組通過分離純化PaP1噬菌體,構(gòu)建載體,表達(dá)純化PaP1噬菌體的DNA聚合酶Gp90,應(yīng)用生物信息學(xué)對這種DNA聚合酶的功能進(jìn)行預(yù)測,并通過實驗完成功能的驗證。同時,本課題組也對真核生物酵母的DNA聚合酶催化結(jié)構(gòu)域Polηcore進(jìn)行研究,分析其通過O6-MeG DNA損傷的動力學(xué)過程。研究的內(nèi)容和結(jié)果如下:1.噬菌體PaP1的DNA聚合酶Gp90的功能鑒定:通過對gene 90進(jìn)行片段擴增,連接到表達(dá)載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中,大量表達(dá)目的蛋白Gp90,裂解菌體后,超速離心,通過Ni柱純化蛋白,得到具有酶活性的DNA聚合酶Gp90。PaP1噬菌體的DNA聚合酶Gp90屬于A-類DNA聚合酶,它同時具有聚合酶活性和3’-5’的外切酶活性。采用生物信息學(xué)方法對Gp90的功能進(jìn)行了預(yù)測,并與同類的其它DNA聚合酶在聚合酶區(qū)域和外切酶區(qū)域分別進(jìn)行了功能比對,發(fā)現(xiàn)Gp90的序列與其它A-類DNA聚合酶(例如T7 DNA Pol和E.coli DNA PolI)具有同源性但并不完全一致。通過同位素標(biāo)記DNA的方法檢測了DNA聚合酶和外切酶活性。聚合酶活性的檢測采用雙鏈DNA全長延伸反應(yīng)、M13長鏈DNA的延伸反應(yīng)、單點插入實驗,發(fā)現(xiàn)Gp90可持續(xù)進(jìn)行DNA復(fù)制,具有較高的延伸性,并且其DNA延伸能力與單個dNTP插入效率都類似于T7 Pol/trx。采用單鏈DNA和雙鏈DNA驗證外切酶活性,發(fā)現(xiàn)Gp90能夠從3’到5’方向剪切單鏈DNA和雙鏈DNA,與T7 Pol/trx的速率相似,但低于T7 Pol/trx的效率。最后,優(yōu)化并確定Gp90聚合反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為:40 m M Tris HCl(p H 8.0),30 m M MgCl2,200 m M NaCl,反應(yīng)溫度為37℃。這些關(guān)于PaP1 DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)都有利于我們增強對噬菌體中所編碼的DNA聚合酶的認(rèn)知,同時也增強理解PaP1感染銅綠假單胞菌的增殖過程。2.酵母菌的DNA聚合酶催化結(jié)構(gòu)域Polηcore跨過O6-MeG損傷的動力學(xué)分析:選擇Polη的催化結(jié)構(gòu)域Polηcore,檢測其通過O6-MeG DNA損傷的動力學(xué)過程。與全長DNA聚合酶Polη(殘基1-632)相比較,Polηcore僅含有N端1-513個氨基酸,缺少參與蛋白相互作用的C端C2H2結(jié)構(gòu)域,因此更能體現(xiàn)出該聚合酶通過DNA損傷的本征活性。首先采用四種dNTP存在下的全長延伸反應(yīng)、穩(wěn)態(tài)單個dNTP插入反應(yīng)和下一位堿基的延伸反應(yīng)、穩(wěn)態(tài)前dCTP的插入反應(yīng)以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析所有延伸產(chǎn)物的序列。Polηcore催化下,在正常G上的錯配率為10-4,在O6-MeG上的錯配率為0.055-0.446。O6-MeG并不影響下一位堿基的延伸效率。在G與O6-MeG上插入dCTP時沒有出現(xiàn)快速動力學(xué)過程,說明dCTP插入過程中的化學(xué)反應(yīng)步驟不會快于隨后的DNA和聚合酶解離的速率。當(dāng)遇到O6-MeG時,引物的延伸被顯著阻斷,大約有67%的d TTP,31%的dCTP和2%的dATP插入到O6-MeG的對位。這些研究為深入理解酵母菌DNA聚合酶在跨過烷基化損傷時的分子機制提供了重要價值。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R3416

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1 劉斌堰;PaP1 DNA聚合酶功能探索與酵母菌DNA聚合酶催化結(jié)構(gòu)域跨損傷動力學(xué)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2016年

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本文編號：1230653