本文關(guān)鍵詞：SLPI基因敲除和敲入小鼠細(xì)胞模型的建立及SLPI促進(jìn)U2OS細(xì)胞遷移的分子機(jī)制研究

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【摘要】：第一部分SLPI基因敲除和敲入小鼠細(xì)胞模型的建立牙齒發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜的過程,是上皮間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的結(jié)果。包括牙胚的發(fā)生、形成、細(xì)胞的分化、基質(zhì)分泌和礦化等幾個(gè)階段�，F(xiàn)在牙齒的形態(tài)發(fā)育已經(jīng)基本研究清楚,但在分子機(jī)制方面,仍有很多待我們探索。SLPI為粘膜上皮細(xì)胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白,包含107個(gè)氨基酸的單鏈多肽,屬于乳清酸性蛋白家族。SLPI由兩段高度同源性的,富含半胱氨酸區(qū)和C末端區(qū)組成,C末端區(qū)具有抑制彈性蛋白酶活性的作用,N末端區(qū)有抗菌、抗逆轉(zhuǎn)率病毒和抗炎活性。雖然牙齒受傷會(huì)誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)SLPI,然而SLPI如何參與牙齒發(fā)育尚未見有人報(bào)道。其在牙本質(zhì)發(fā)育過程中有什么作用?通過什么樣的分子機(jī)制實(shí)現(xiàn)?機(jī)制研究需要?jiǎng)游锖图?xì)胞模型,本論文第一部分主要是建立SLPI基因沉默和SLPI基因過表達(dá)的動(dòng)物和細(xì)胞模型,為下一步研究SLPI在牙齒發(fā)育中作用及其機(jī)制做好鋪墊。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果：1、通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,構(gòu)建鼠源SLPI基因過表達(dá)載體pCMV6-SLPI(+)-GFP;2、通過經(jīng)典育種與PCR相結(jié)合的方法,進(jìn)行SLPI基因過表達(dá)純合子小鼠的建系；3、原代培養(yǎng)了SLPI基因野生型牙胚細(xì)胞和SLPI基因敲除的牙胚細(xì)胞。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)主要是,完成SLPI基因過表達(dá)小鼠的純合子驗(yàn)證,原代培養(yǎng)SLPI基因過表達(dá)的牙胚細(xì)胞,通過western blot和免疫組化研究SLPI基因在牙齒發(fā)育中的作用及其機(jī)制。第二部分SLPI促進(jìn)U20S細(xì)胞遷移的分子機(jī)制研究隨著生態(tài)環(huán)境的惡化和生活方式的不健康,癌癥發(fā)病率逐年上升,現(xiàn)已成為威脅人類健康的頭號(hào)殺手。現(xiàn)在癌癥治療方法主要有,手術(shù)切除、放療、化療。但這些治療方法仍無(wú)法克服腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。我們通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SLPI具有促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞遷移的能力,并推測(cè)出了其可能的作用通路。另有文獻(xiàn)報(bào)道,很多腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移時(shí),體內(nèi)SLPI高表達(dá),但機(jī)制還未研究清楚。因此我們推測(cè)促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞遷移的SLPI在腫瘤細(xì)胞的遷移中也發(fā)揮著一定的作用,因此通過SLPI基因過表達(dá)來(lái)確定SLPI促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制,通過SLPI基因沉默來(lái)確定SLPI是否降低腫瘤細(xì)胞的遷移及其機(jī)制。本論文選取腫瘤中在青少年中較為高發(fā)的骨肉瘤作為研究對(duì)象,通過構(gòu)建SLPI基因過表達(dá)細(xì)胞系和SLPI基因沉默模型,并用ERK1/2抑制劑U0126處理,來(lái)探究SLPI基因是否通過激活ERK1/2信號(hào)路徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移,SLPI基因沉默SLPI是否通過抑制ERK1/2信號(hào)通路降低腫瘤細(xì)胞的遷移。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果：1、構(gòu)建人源SLPI基因過表達(dá)的載體pCMV6-SLPI-GFP,并將pCMV6-SLPI-GFP和pCMV6-AC-GFP轉(zhuǎn)染U20S細(xì)胞,然后挑選單克隆培養(yǎng)成穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系；2、通過PCR和western blot實(shí)驗(yàn),確定了siRNA干擾的U20S細(xì)胞內(nèi)源性SLPI表達(dá)的最佳條件；3、通過細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),初步確認(rèn)了SLPI基因過表達(dá)促進(jìn)U20S細(xì)胞遷移,SLPI基因沉默降低U2OS細(xì)胞遷移；4、通過明膠酶譜和western blot實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了我們猜測(cè)的通路。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R33

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本文編號(hào)：1180950