本文關(guān)鍵詞：SLPI基因敲除和敲入小鼠細胞模型的建立及SLPI促進U2OS細胞遷移的分子機制研究

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【摘要】：第一部分SLPI基因敲除和敲入小鼠細胞模型的建立牙齒發(fā)育是一個長期復(fù)雜的過程,是上皮間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的結(jié)果。包括牙胚的發(fā)生、形成、細胞的分化、基質(zhì)分泌和礦化等幾個階段�，F(xiàn)在牙齒的形態(tài)發(fā)育已經(jīng)基本研究清楚,但在分子機制方面,仍有很多待我們探索。SLPI為粘膜上皮細胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白,包含107個氨基酸的單鏈多肽,屬于乳清酸性蛋白家族。SLPI由兩段高度同源性的,富含半胱氨酸區(qū)和C末端區(qū)組成,C末端區(qū)具有抑制彈性蛋白酶活性的作用,N末端區(qū)有抗菌、抗逆轉(zhuǎn)率病毒和抗炎活性。雖然牙齒受傷會誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細胞表達SLPI,然而SLPI如何參與牙齒發(fā)育尚未見有人報道。其在牙本質(zhì)發(fā)育過程中有什么作用?通過什么樣的分子機制實現(xiàn)?機制研究需要動物和細胞模型,本論文第一部分主要是建立SLPI基因沉默和SLPI基因過表達的動物和細胞模型,為下一步研究SLPI在牙齒發(fā)育中作用及其機制做好鋪墊。實驗內(nèi)容和結(jié)果：1、通過分子生物學(xué)實驗方法,構(gòu)建鼠源SLPI基因過表達載體pCMV6-SLPI(+)-GFP;2、通過經(jīng)典育種與PCR相結(jié)合的方法,進行SLPI基因過表達純合子小鼠的建系；3、原代培養(yǎng)了SLPI基因野生型牙胚細胞和SLPI基因敲除的牙胚細胞。后續(xù)的實驗主要是,完成SLPI基因過表達小鼠的純合子驗證,原代培養(yǎng)SLPI基因過表達的牙胚細胞,通過western blot和免疫組化研究SLPI基因在牙齒發(fā)育中的作用及其機制。第二部分SLPI促進U20S細胞遷移的分子機制研究隨著生態(tài)環(huán)境的惡化和生活方式的不健康,癌癥發(fā)病率逐年上升,現(xiàn)已成為威脅人類健康的頭號殺手。現(xiàn)在癌癥治療方法主要有,手術(shù)切除、放療、化療。但這些治療方法仍無法克服腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移的發(fā)生。我們通過前期實驗發(fā)現(xiàn)SLPI具有促進成牙本質(zhì)細胞遷移的能力,并推測出了其可能的作用通路。另有文獻報道,很多腫瘤細胞發(fā)生遷移時,體內(nèi)SLPI高表達,但機制還未研究清楚。因此我們推測促進成牙本質(zhì)細胞遷移的SLPI在腫瘤細胞的遷移中也發(fā)揮著一定的作用,因此通過SLPI基因過表達來確定SLPI促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的機制,通過SLPI基因沉默來確定SLPI是否降低腫瘤細胞的遷移及其機制。本論文選取腫瘤中在青少年中較為高發(fā)的骨肉瘤作為研究對象,通過構(gòu)建SLPI基因過表達細胞系和SLPI基因沉默模型,并用ERK1/2抑制劑U0126處理,來探究SLPI基因是否通過激活ERK1/2信號路徑促進腫瘤細胞的遷移,SLPI基因沉默SLPI是否通過抑制ERK1/2信號通路降低腫瘤細胞的遷移。實驗內(nèi)容和結(jié)果：1、構(gòu)建人源SLPI基因過表達的載體pCMV6-SLPI-GFP,并將pCMV6-SLPI-GFP和pCMV6-AC-GFP轉(zhuǎn)染U20S細胞,然后挑選單克隆培養(yǎng)成穩(wěn)定表達的單克隆細胞系；2、通過PCR和western blot實驗,確定了siRNA干擾的U20S細胞內(nèi)源性SLPI表達的最佳條件；3、通過細胞遷移實驗,初步確認了SLPI基因過表達促進U20S細胞遷移,SLPI基因沉默降低U2OS細胞遷移；4、通過明膠酶譜和western blot實驗初步驗證了我們猜測的通路。
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R33

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本文編號：1180950