本文關鍵詞：骨髓間充質干細胞動脈靶向移植對兔急性腎小管壞死模型的治療研究

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【摘要】：目的：掌握實驗兔急性腎小管壞死模型的建立與自體骨髓間充質干細胞的獲取、制備和培養(yǎng)方法。采用經腎動脈靶向灌注移植兔自體骨髓間充質干細胞,與未治療對照組比較,觀察移植后的骨髓間充質干細胞對缺血再灌注損傷引起的急性腎小管壞死的修復作用及其對腎功能恢復的影響。為骨髓間充質干細胞移植治療急性腎小管壞死的臨床應用推廣提供實驗依據。方法：1、實驗兔自體骨髓間充質干細胞的獲取與培養(yǎng)：8只健康日本大耳白兔,體質量2±0.5Kg,隨機分成兩組(BM-MSCs移植組和對照組),每組各4只;模型建立前所有實驗兔均采血行血肌酐、尿素氮檢測并記錄。在模型建立后24h移植組與對照組各隨機選1只兔處死,切除腎臟行病理學觀察。移植組其余3只兔在無菌條件下采集骨髓各5ml,以貼壁培養(yǎng)法分離自體BM-MSCs并進行原代及傳代培養(yǎng),培養(yǎng)過程中進行細胞形態(tài)學觀察。隨機選取其中一瓶P2代細胞做(4,6-聯脒-2-苯基吲哚4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)標記并在顯微鏡下觀察。2、建立實驗兔急性腎小管壞死模型：采用缺血再灌注損傷機制建立模型。全部實驗兔在無菌靜脈麻醉狀態(tài)下,開腹鈍性分離雙側腎動脈,采用無損傷血管鉗夾閉雙腎動脈90min,觀察腎臟變化(包括體積、顏色、外觀形態(tài)等),去夾恢復腎動脈血流灌注。模型建立后24h,對照組及移植組各隨機選取1只實驗兔處死并取腎組織,病理學觀察腎小管壞死情況；建立模型后3小時、24小時檢測血肌酐和尿素氮水平并記錄。通過觀察血生化指標變化與病理學改變,確定腎小管壞死模型建立成功。3、動脈靶向灌注兔自體骨髓間充質干細胞并與對照組對比觀察：(1)移植組(3只)：麻醉下開腹分離腹主動脈下段(約齊雙側髂總動脈分叉部上方)采用Sel dinger穿刺技術,插入3F Progreat微導管約5cm至腎動脈開口水平,緩慢灌注兔自體BM-MSCs懸液2ml/kg,退微導管及導管鞘,穿刺點采用可吸收性無損傷縫合線縫合,待無出血、滲血后逐層關腹。(2)對照組(3只),與移植組在同一時間點,經腹股溝內側靜脈緩慢注入等量生理鹽水作對比組觀察。(3)兩組間對比觀察：移植BM-MSCs術后,兩組分別于3d、5d、7d采血檢測血肌酐、尿素氮,對比分析兩組間差異。7d后移植組實驗兔在麻醉狀態(tài)下,用10%的甲醛行雙側腎臟灌注固定后取材,對標本行冰凍切片并在熒光顯微鏡下觀察干細胞歸巢情況。結果：1、BM-MSCs的擴增培養(yǎng)：3只移植組獲取骨髓,細胞接種24h后可見少量細胞貼壁;3-4d后可見細胞集落形成。5-7d可見細胞鋪滿瓶底,達到融合狀態(tài),可進行傳代培養(yǎng)。第3代以后,細胞分裂活躍,細胞形態(tài)呈成纖維狀改變,大部分呈長梭狀。2、實驗兔腎缺血再灌注損傷模型建立后,病理學觀察顯示腎小管上皮細胞均有不同程度變性、壞死。動脈移植BM-MSCs后7d,熒光顯微鏡下可觀察到經DAPI標記的BM-MSCs沉積于腎組織。3、兔急性腎小管壞死模型建立前血肌酐(x±s)103.88±8.11 μmol/L,尿素氮(x±s)8.79±0.75mmol/L。模型建立后,分別于3h、24h采血觀察：血肌酐及尿素氮水平明顯倍增,分別為3h 211.75±14.52 μmol/L及18.71±1.20mmol/L；24h 339.63±26.36μmol/L及24.06±2.56mmol/L。模型建立前與模型建立后3h、24h比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.BM-MSCs移植后通過采血檢測分析,移植后3d移植組血肌酐、尿素氮水平與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P0.05)。移植后第5d起移植組血肌酐、尿素氮水平均低于對照組,組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第7d動脈組血肌酐、尿素氮分別為116.33±12.50 μ mol/L和10.13±2.78mmol/L顯著低于對照組243.67±17.21 μmol/L和17.62±1.47mmol/L,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論：1、實驗兔采用夾閉雙腎動脈90min后恢復血流再灌注,能快速成功的建立急性缺血性再灌注損傷后急性腎小管壞死模型。2、經動脈內插管灌注的BM-MSCs可向損傷腎組織歸巢,且在移植7天后DAPI仍保持熒光特性。3、BM-MSCs行動脈內插管早期靶向移植可以有效改善急性缺血性再灌注損傷后急性腎小管壞死腎功能的恢復。
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R699.2

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